基于液相色谱-四极杆飞行时间质谱方法分析冰鲜鸡肉代谢标志物

王珂雯，徐 雷，徐贞贞，王 雪，杨曙明

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

国家统计局数据显示，2019年我国肉类产量达7 758.78万 t，居世界第一，其中禽肉占比达29%，是我国第二大肉类产品。目前我国鸡肉总产量为1 260万 t，其中，黄羽肉鸡消费量已达鸡肉总消费量的40%，且其产量还在持续上涨，是我国禽类产业高质量发展的增长点之一[1]。另一方面，自禽流感爆发以来，活禽交易在我国各地相继被禁止[2]，目前禽类产品多以“白条鸡”形式上市[3]。在产业转型和政府施策的背景下，市售鸡肉，特别是黄羽肉鸡多以冰鲜鸡和冷冻鸡为主要销售形式。禽类产业开始实施“集中屠宰、冷链配送、生鲜上市”的模式[2]，使消费者对冰鲜鸡的接受程度逐渐增强[4]。

冰鲜鸡肉指屠宰后贮存温度保持在-3～4 ℃的鸡肉，冷冻鸡肉指一直以-18 ℃或更低温度贮存的鸡肉[5]。与冷冻鸡肉相比，冰鲜鸡肉无需冷冻，避免了冰晶的形成和再结晶[6]，减少了冰晶对鸡肉微观结构造成的物理破坏，保留鸡肉的感官和营养品质[7]。然而，冰鲜鸡肉在低温贮存中，容易发生微生物腐败[8]，不利于鸡肉的感官和安全品质[9]。此外，由于检测技术的局限，针对同一物种的隐蔽性掺假行为研究较少[10]。因此，需要对冰鲜鸡代谢物进行全面且深入的研究，了解冰鲜鸡品质变化特征以及冰鲜鸡肉与鲜鸡肉的代谢物差异，实现冰鲜鸡市场的顺利拓展，调动市场积极性，达到保障食品安全与品质的双重目标。

冰鲜鸡肉的代谢和品质变化是一个非常复杂的过程，目前对该问题的研究主要集中在分析与代谢相关的物理化学指标上。巨晓军等[11]使用pH值、失水率、嫩度、肉色值、肌苷酸等指标，对不同贮存时间的冰鲜鸡肉与鲜鸡肉进行比较，发现冰鲜鸡肉贮存6 d之内品质变化较小。王虎虎等[12]使用气相色谱和液相色谱对冰鲜鸡肉与鲜鸡肉中的核苷酸、氨基酸、还原糖等物质进行定量测定。相比于这些方法，代谢组学可全面分析有机组织和生物液体中低分子质量代谢物[10]，实现监测肉类代谢物的动态变化[13]，降低遗漏重要代谢物的可能，操作更为简便。一般来说，在生物体代谢过程中，含量变化具有一定规律的物质更能反映生物体的代谢过程，因此，代谢组学关注的是差异物。进一步，当这些代谢差异物含量变化可以解释机体的某些生理生化过程时，代谢差异物可以作为代谢标志物进行后续分析。比如，在牛肉腌制过程中，氨基酸、糖、醋酸、琥珀酸、尿嘧啶和肌苷含量升高，乳酸、肌酸、肌苷-5-磷酸和鹅肌肽含量降低，这些代谢差异物含量的变化与腌制牛肉风味的形成存在相关性，可以作为牛肉腌制过程中的代谢标志物[14]。

在对庞大的代谢组学数据进行挖掘和筛选时，最常用的多元统计分析模型为主成分分析（principal component analysis，PCA）。Xu Lei等[15]采用PCA对3 种制作方式的咖啡代谢物数据进行分析，PC1的贡献率为31.6%，PC2的贡献率为19.8%。Balog等[16]采用三维PCA对3 种烹饪方式获得的牛肉代谢物数据进行分析。与PCA不同，正交偏最小二乘（orthogonal partial least square，OPLS）法是一种回归模型，可以利用有限的变量获取代谢物与响应变量之间的相关性[17-18]，目前该模型的使用较少，仅有的研究将其应用于微生物[19-20]和唾液代谢物分析[21]。本研究首次在鸡肉代谢物分析中使用OPLS模型，以探究OPLS模型鉴别不同贮存时间冰鲜鸡肉和鲜鸡肉的可行性。

本实验中，研究对象为北京油鸡，属于肉蛋兼用型黄羽肉鸡，国家级畜禽遗传资源的保护鸡种，近年来已在华北、东北等地推广养殖与销售[22]。Zhao Guiping等[23]研究表明，从肉质性状、肌纤维特征、营养成分和含量等角度来说，北京油鸡与AA白羽肉鸡相比，具有明显的优势。目前，国内外对北京油鸡的研究多集中于肌肉品质性状相关的遗传分子标记、筛选及饲养、日龄等对油鸡肉品质的影响等[24-27]，而关于其冰鲜鸡肉和鲜鸡肉的代谢物研究较少。基于此，本研究采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱（liquid chromatography-quadruple time-offlight mass spectrometry，LC-QTOFMS）技术对不同贮存时间的北京油鸡冰鲜鸡肉（1、3、5、7、10 d）和北京油鸡鲜鸡肉（0 d）进行非靶向代谢组学分析，将OPLS模型应用于鸡肉代谢组学分析中，筛选出潜在标志物，寻找冰鲜鸡肉和鲜鸡肉在代谢物组成上的差异与相似性。本研究旨在为冰鲜鸡肉的代谢物研究提供思路，为冰鲜鸡肉的贮存提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

北京油鸡公鸡样本来自北京百年栗园生态农业有限公司密云区百年栗园养殖基地。所有样本来自同一养殖区域，样本散养日龄为120～150 d，平均体质量为1.5 kg。当日屠宰的鸡肉及时预冷至4 ℃，达到冰鲜要求，在无菌状态下冷链运输，3 h内转移到实验室，进行后续贮藏期实验。

甲酸、甲醇（均为色谱纯） 北京迪马科技有限公司；乙腈（色谱纯） 美国Thermo Fisher Scientific公司；超纯水由Milli-Q一体化水净化系统制备。

1.2 仪器与设备

TripleTOF 6600超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪美国AB SCIEX公司；Milli-Q Advantage A10纯水系统德国Merck Millipore公司；SK8200LHC超声波清洗器上海科导超声仪有限公司；08F107-42天平 武汉艾德姆衡器有限公司；3K15高速冷冻离心机 德国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 鸡肉样品制备

真空包装的公鸡样本运输到达实验室后，取鸡胸肉组织，混合均匀，使用食品级自封袋分装，贮存在4 ℃。屠宰当天的鸡肉为第0天的样本，记录为鲜鸡肉，其余鸡肉在4 ℃条件下贮存1、3、5、7、10 d，记录为不同贮存时间的冰鲜鸡肉，每天的鸡肉样品进行5 个生物学重复。贮存一定时间后，取出鸡胸肉样品，匀浆，准确称取100 mg样品，进行提取操作。样本提取程序参考Sidwick等[10]的研究。向样品中加入50%甲醇溶液1 mL，超声提取10 min，16 100×g离心20 min。上清液作为水提液保留，剩余不溶组织进行进一步提取。按照每100 mg剩余不溶组织加入1 mL二氯甲烷-甲醇（3∶1，V/V）的比例加入提取液，用干净的吸管对不溶组织颗粒进行破碎，并对不溶组织颗粒超声处理10 min，16 100×g离心20 min。2 次提取得到的上清液转移至玻璃瓶中，于通风橱中蒸发过夜。蒸发后的样品在甲醇中重悬到相同体积，使用0.22 μm有机系滤膜过滤后上机。

1.3.2 质量控制样品制备

在分析过程中，质量控制（quality control，QC）样品是对每个样品等量取样并均匀混合得到的样品[28]，用于检测分析的重现性和稳定性[10]。QC样品的制备参考Wilson等的研究[29]。按照1.3.1节方法获得各个样品的提取液，等量取样，均匀混合，得到的样品记为QC样品。为了确保基线的稳定性，在实验开始时使用大量的QC样品上机进样。对鸡肉样品分析时，每分析5 个样品，使用QC样品上机进样1 次，确保检测分析过程的稳定性和可重复性。在整个分析过程中，从QC样品上标记峰面积计算出变异系数，以监测数据的精确度。变异系数超过20%的QC样品需要去除[30]。

1.3.3 色谱和质谱条件

色谱条件：Ec lipse Plus®C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。进样量3 μL，流速0.3 mL/min，柱温40 ℃。流动相A为0.1%甲酸，流动相B为3 mmol/L乙腈溶液含0.1%甲酸。正离子模式下洗脱梯度：0～1 min，95%～47.5% A，5%～52.5% B；1～22 min，48%～0% A，52%～100% B；22～27 min，0% A，100% B；27～27.1 min，0%～95% A，100%～5% B；27.1～30 min，95% A，5% B。负离子模式下洗脱梯度：0～1 min，95%～40% A，5%～60% B；1～10 min，40%～35% A，60%～65% B；10～12 min，35%～20% A，65%～80% B；12～15 min，20%～0% A，80%～100% B；15～22 min，0% A，100% B；22～22.1 min，0%～95% A，100%～5% B。

质谱条件：电喷雾离子源；质量扫描范围m/z50～1 000。正离子扫描方式：离子源温度550 ℃，喷雾电压5 500 V，雾化气压力50 psi，辅助加热气压力50 psi，气帘气压力25 psi，去簇电压80 V，离子碰撞能量10 eV。负离子扫描方式：离子源温度550 ℃，喷雾电压-4 500 V，雾化气压力50 psi，辅助加热气压力50 psi，气帘气压力30 psi，去簇电压-80 V，离子碰撞能量-10 eV。

1.3.4 数据采集和预处理

使用PeakView 2.2软件对数据进行采集和预处理，包括数据挖掘、峰校准和筛选。数据挖掘的范围m/z50～1 000，保留时间0.5～22 min；峰校准和筛选：质量数偏差为10×10-6，保留时间偏差0.5 min，对强度大于100的峰进行筛选。

1.3.5 非靶向代谢物鉴定及数据可视化

数据预处理后将峰度信息导入到SIMCA-P 14.1（瑞典Umetrics公司）软件中进行OPLS分析，采用交叉验证方差分析（cross validation-analysis of variance，CVANOVA）对该模型的可靠性进行验证，确认模型的可靠性后，根据变异权重参数值（variable importance in projection，VIP）大于1，相关性系数绝对值大于0.40，以及P值小于0.05 筛选出潜在标志物。利用MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca）绘制潜在标志物热图，并对热图数据进行分层聚类分析。将差异物导入Peakview软件，利用“Formula Finder”确定分子式，理论和实际的质量偏差小于5×10-6，同位素分布在理论分布范围的20%以内，得到潜在标志物的二级信息，将其导入Massbank数据库（http://www.massbank.jp），得到潜在标志物的二级信息，使用Origin 2018（Microcal Software, Inc., MA,USA）软件将实验和数据库中的二级质谱信息绘制于镜像图中，对潜在标志物进行验证。

2 结果与分析

2.1 QC样品分析

经过所有QC样品比对，LC-QTOF MS的总离子色谱图在正离子模式下共提取到370 个化合物峰，在负离子模式下提取276 个化合物峰。如图1所示，不同颜色表示不同的QC样品。不同QC样品峰的重叠程度大则表明检测系统较好的稳定性，实验数据也更加可靠，因此，图1B表明负离子模式采集的数据更加可靠。

图1 QC样品的总离子色谱图Fig. 1 Total ion current chromatograms of QC samples

2.2 OPLS模型分析

不同贮存时间的冰鲜鸡肉和鲜鸡肉样品上机检测，得到代谢物的峰度信息，将数据预处理后导入SIMCA-P 14.1，在正负离子模式下分别进行OPLS模型拟合，以代谢物水平与贮存时间作为响应变量。采用CV-ANOVA对模型进行验证，2 种模式下的模型均满足P值小于0.001，表明OPLS模型具有可靠性，可以进行后续分析[31]。图2表明，在负离子模式下，同一天的鸡肉样品可以更好地被归为同一组，6 d的样品被分为6 组。在正离子模式下，OPLS模型的R2和Q2为0.94和0.79，负离子模式R2和Q2为0.99和0.80。理论上讲，R2和Q2的值越接近1说明模型越可靠[32]。因此，负离子模式下的OPLS模型具有更好的预测性，且结合2.1节结果，负离子模式下的QC样品峰重叠程度更大，表明负离子模式下检测系统具有较好的稳定性，实验数据更加可靠，因此，后续分析基于负离子模式下采集的数据。

图2 鸡肉样品的OPLS得分图和Y预测值图Fig. 2 OPLS scores and predicted Y values of chicken samples

2.3 代谢物筛选

在负离子模式下，以VIP值大于1、相关性系数绝对值大于0.40和P值小于0.05作为筛选条件，筛选出29 个差异物。使用MetaboAnalyst软件对29 个差异物绘制热图，并对热图进行分层聚类分析，得到图3。化合物在不同鸡肉样品中的浓度用热图颜色表示。图3为潜在标志物的变化趋势，从中可以直观看出差异物在不同鸡肉样品中的变化。

图3 负离子模式下不同鸡肉样品中化合物含量变化的趋势图Fig. 3 Trends in compound contents in different chicken samples in negetive ion mode

根据对不同鸡肉样品的分层聚类结果，30 个鸡肉样品主要分为3 类（图4）。第1类由鲜鸡肉的5 个样品组成，第2类主要由贮存1、3 d和5 d的冰鲜鸡肉样品组成，第3类主要由贮存7 d和10 d的冰鲜鸡肉组成，表明从代谢物角度来说，贮存5 d以内的冰鲜鸡肉与鲜鸡肉具有更大的相似性，随着贮存时间的延长，冰鲜鸡肉与鲜鸡肉代谢物差异逐渐增加。根据对不同化合物的分层聚类分析，发现这些代谢物可以分为2 类，其中第1类化合物主要表现为在贮存过程含量逐渐降低，而第2类化合物主要表现为在贮存过程中含量逐渐增多。

图4 负离子模式下不同鸡肉样品中29 个潜在标志物的分层聚类分析热图Fig. 4 Heatmap from hierarchical clustering analysis of 29 potential metabolite markers from chicken samples in negative mode

2.4 差异物鉴定及分析

将29 个差异物的信息导入Peakview软件，利用“Formula Finder”确定分子式，理论和实际的质量偏差小于5×10-6，同位素分布在理论分布范围的20%以内。从中得到的物质二级信息导入Massbank数据库，进行分子结构确定，得到潜在标志物的分子式（表1），这些标志物主要包括氨基酸、多肽、脂肪酸和核苷酸等。上述标志物与Massbank数据库中检索到的二级质谱图进行匹配验证，得到潜在标志物的质谱信息镜像图（图5）。

图5 不同鸡肉样品潜在标志物的质谱镜像图Fig. 5 Mirror plots of tandem mass spectra of potential metabolites markers in different chicken samples

表1 潜在标志物的分子式Table 1 Basic information about potential metabolite markers

内源性以及微生物中的蛋白酶和脂肪酶的水解作用，是造成肉类和肉制品品质变化的重要原因[33-34]。因此，肉制品贮存过程中氨基酸、肽和脂肪酸含量的变化可以反映肉制品的代谢过程以及相关生理生化反应。动物体内约2/3的色氨酸来源于组织蛋白分解的内源性色氨酸[35]，其与苯丙氨酸等8 种氨基酸称为必需氨基酸[36]。与肉类风味相关的游离氨基酸，如色氨酸和苯丙氨酸，可以反映肉类品质[37]。随着贮存时间的延长，鸡肉中的色氨酸（95号）和苯丙氨酸（72号）含量增加，可能是鸡肉中的蛋白质逐渐被蛋白酶和微生物水解产生小分子氨基酸[38]。图6A和图6B表明，色氨酸和苯丙氨酸含量在0～5 d的鸡肉样品中无显著差异，贮存7 d后，两物质含量均显著升高，表明鲜鸡肉和贮存5 d内的冰鲜鸡肉蛋白质降解反应几乎没有发生，贮存5 d后，降解反应显著增加，不利于冰鲜鸡肉的感官品质。Wen Dongling[39]和王虎虎[12]等的研究与本实验结果相似。

鹅肌肽为肌肽的甲基化衍生物，两者为组氨酸二肽，具有显著的抗氧化作用，是肉类的内源性抗氧化剂，已被证明可以保护肉类免受氧化性品质恶化[40]，并且有利于形成肉类良好的风味和细嫩的质地[41]。Sundekilde等[42]的研究表明，在营养不良的鸡中，鸡肉肌肽和鹅肌肽含量均显著降低。因此，肌肽和鹅肌肽对鸡肉品质有重要意义。图6C和图6D表明，随着贮存时间的延长，肌肽（107号）和鹅肌肽（112号）含量有所下降，肌肽在贮存1 d后含量显著下降，鹅肌肽在贮存7 d后含量显著下降，说明2 个物质在鸡肉贮存中发挥抗氧化作用的时间阶段不同，肌肽主要在贮存前期被消耗，一段时间后，鹅肌肽才开始发挥抗氧化作用被消耗，这2 种物质的减少不利于鸡肉风味和质地的保持。

棕榈酸属于中长链饱和脂肪酸，在鸡肉中含量较高，相对含量约为25%[43]。图6E表明，与鲜鸡肉相比，棕榈酸（119号）含量在第3天显著增加，并在3 d后呈现逐渐升高的趋势，与王虎虎等[12]的结果一致。甘油三酯在酸性和碱性或脂肪酶活跃的条件下，容易分解为脂肪酸和甘油，而鸡肉贮存过程中，随着蛋白质的降解和其他代谢物含量的变化，造成体系酸碱度的改变，促进油脂降解生成脂肪酸，最终表现为棕榈酸含量的显著增加。此外，色氨酸的存在可能会促进甘油三酯的降解[44]。

二十碳五烯酸又称花生五烯酸，属于ω-3脂肪酸，是人体的必需脂肪酸，可以降低心脑血管疾病风险[45]。一般来说，鸡肉中不饱和脂肪酸含量高于饱和脂肪酸含量，其中二十碳五烯酸的相对含量约为25%[43]。Stanton等[46]的研究表明，有规律地摄入二十碳五烯酸丰富的鸡肉有助于人体血浆多不饱和脂肪酸的升高，在一定程度上可以代替部分鱼类和营养补充剂。鸡肉中二十碳五烯酸含量与饲料相关，研究表明，使用含有α-亚麻酸的饲料显著提高了鸡胸肉中二十碳五烯酸的含量[47]。图6F表明，与鲜鸡肉相比，贮存5 d的冰鲜鸡肉二十碳五烯酸（144号）含量显著升高，这与吕学泽等[48]的研究相似。由于肌肽和鹅肌肽通过抑制脂肪过氧化和蛋白质损伤保护肉类免受氧化[49]，推测本实验中二十碳五烯酸含量略微上升的原因与油脂的水解反应增多，以及鸡肉中鹅肌肽和肌肽在冷藏过程中良好地保护了多不饱和脂肪酸，防止二十碳五烯酸的氧化2 个因素有关。冰鲜鸡肉贮存中表现出的多不饱和脂肪酸保护作用并未在鸡肉冷冻贮存过程中发现，Miteva等[50]的研究表明鸡肉冷冻贮存中不饱和脂肪酸显著降低。

除了上述与蛋白质和脂肪代谢相关的物质外，某些核苷酸类物质在肉类贮存中的风味变化中有重要意义。肌苷酸是肉类的主要风味成分，但是它在肉类中不稳定，可以降解为肌苷和次黄嘌呤。在其降解产物中，肌苷和次黄嘌呤具有苦味，不利于肉类在贮藏过程中的风味变化[51-52]。因此，肌苷酸已成为衡量肉类新鲜度的重要指标。图6G表明，贮存1 d的鸡肉肌苷酸（185号）含量显著降低，与肌苷酸极不稳定的特性一致，说明冰鲜鸡肉风味发生不良转变，食用品质有所降低。

图6 鸡肉样品代谢物含量变化Fig. 6 Changes in metabolite contents in chicken samples

综合上述分析，这7 种蛋白质、脂肪和核苷酸降解产物反映了鸡肉贮存中的生化过程和风味变化，可以作为冰鲜鸡肉的代谢标志物。从代谢物的角度看，贮存时间在5 d内的冰鲜鸡可以认为与鲜鸡肉代谢物相似性更高，随着贮存时间的延长，冰鲜鸡肉与鲜鸡肉代谢物差异逐渐增加。

3 结 论

本实验基于代谢组学方法，结合OPLS模型鉴别不同贮存时间的冰鲜鸡肉和鲜鸡肉，分析各个鸡肉样品的多种代谢物，阐述了贮存时间对鸡肉代谢物的影响。筛选了29 种差异物，并经过二级质谱的匹配，确定9 种物质的结构式，包括蛋白质、脂肪和核苷酸降解产物等。随着贮存时间的延长，鸡肉中苯丙氨酸、色氨酸、棕榈酸和二十碳五烯酸含量有所上升，肌肽、鹅肌肽和肌苷酸等物质含量有所降低，表明贮存时间的延长会造成鸡肉抗氧化物质减少，鸡肉风味改变，促进了冰鲜鸡肉中脂肪酸的形成与稳定。从代谢物角度来说，贮存时间在5 d内的冰鲜鸡肉与鲜鸡肉代谢物构成上最为接近。本实验表明基于LC-QTOF MS代谢组学方法结合OPLS模型，对冰鲜鸡肉和鲜鸡肉的鉴别具有可行性，为冰鲜鸡的质量安全与品质评价提供数据支撑。后续应进一步研究相关标志物的形成机制与变化规律，为调控蛋白质和呈味核苷酸的降解、提高冰鲜鸡产品品质提供理论依据。此外，本实验针对北京油鸡品种的冰鲜鸡肉和鲜鸡肉代谢物进行分析，后续可以考虑应用在其他品种鸡肉样本中，为全面分析冰鲜鸡肉和鲜鸡肉代谢物标志物提供参考。