克罗诺杆菌属快速检测体系的建立

王丹丹，李 莉，杨艳歌，刘鸣畅，王洪越，吴淑清，袁 飞,*，吴亚君,*

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.长春大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130022）

克罗诺杆菌属（Cronobacterspp.）是一种重要的食源性病原体，其存在于土壤、水以及人和动物肠道中[1-3]。对于婴儿，尤其是体质量低于2 500 g的早产儿[4-5]，具有很高的感染风险。克罗诺杆菌属与新生儿脑膜炎病例、坏死性小肠结肠炎、败血症、血痢和脑脓肿相关[6-8]。有研究表明，克罗诺杆菌能在婴儿奶粉中长期存活[9]，因此对克罗诺杆菌属的及时检出是预防其危害发生的重要手段。

传统微生物生理生化法检测时间长，且检测步骤繁琐[10-11]，因此近年来众多研究者对微生物快检技术进行了探索研究，目前市面上微生物快检产品主要有即用型微生物快速检测板[12]、显色培养基[13-14]、ATP荧光检测仪[15-17]、胶体金免疫层析试纸条[18-19]、进口的微生物快速检测系统等[20-22]。但是微生物测试片、快速检测板、显色培养基都需要进行长时间的增菌过程[23-24]，因此检测时间较长，无法实现微生物快速检测。ATP荧光检测法对检测样品基质要求较高，大多应用于水质检测以及环境微生物的检测，无法对食品等复杂基质样品进行微生物检测[25-26]。胶体金免疫层析试纸条其检测限为106CFU/mL，检测灵敏度较差[24,27]，导致其应用受到限制。目前进口的微生物快速检测系统，虽然样品前处理简单，但其设备成本较高，且也需要增菌过程，故检测时间较长。

实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技术是在普通PCR基础上添加荧光染料或荧光探针[28]，通过PCR产物的积累，使得荧光信号增加[29-30]。相比于传统PCR技术，real-time PCR技术能实现实时对待检成分进行定性、定量分析，无需进行电泳，节省了检测时间[31-32]，目前被广泛用于微生物的检测研究。本研究建立集克罗诺杆菌属一步法DNA提取和快速real-time PCR方法为一体的速测技术，通过方法优化，整个检测流程可在40 min内完成。同时对建立的一步法DNA提取技术与传统煮沸法进行比较，显示检测灵敏度几乎与传统的煮沸法等同，该方法在不前增菌情况下对克罗诺杆菌的检测灵敏度可达104CFU/mL，在短时间（8 h）前增菌的情况下灵敏度可达10 CFU/mL，大大缩短了检测时间，以期为口岸食源性病源微生物现场快速检测提供良好的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

婴幼儿配方奶粉1段购自北京某超市。丙二酸盐阳性克罗诺杆菌（DSM18702） 德国菌种细胞保藏中心；阪崎肠杆菌（ATCC29544） 美国菌种保藏中心；均贮存于中国检验检疫科学研究院菌种库。

胰蛋白胨大豆汤（tryptone soya broth，TSB）培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（tryptone soya ager，TSA）培养基英国Oxoid公司；PrepManTMUltra Sample preparation Reagent试剂盒 美国Thermo Fisher公司；DNA提取试剂盒 英国MicroGEM公司；2×TaqMan Fast qPCR Master MIX (Low Rox) BBI Life Sciences公司；QuantiNova Probe PCR Kit（100） 德国QIAGEN公司；Luna Universal Probe qPCR Master Mix美国BioLabs公司；GoldstarTaqMan Miture (Low Rox)和HyperProbe Mixture 北京康为世纪生物科技有限公司；TaqMan Fast Advanced Master Mix、TaqManTMGene Expression Master Mix 美国Applied Biosystems公司；SsoAdvanced Universal Probes Supermix 美国Bio-Rad Laboratories公司。

1.2 仪器与设备

D2012 plus高速可调离心机、NANODROP 2000C紫外分光光度仪 美国Thermo Fisher公司；涡旋混合器 德国IKA公司；拍击式均质器 法国Interscience公司；高压灭菌锅 以色列Tuttnauer公司；DH-420电热恒温培养箱 美国Memmert公司；水浴锅金坛市白塔新宝仪器厂；DNA PDQex核酸提取仪英国MicroGEM公司；迷你实时荧光PCR仪 杭州安塔生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养

将克罗诺杆菌属进行活化，接种于TSB培养基中，37 ℃培养过夜[33]，然后将活化的菌落进行保存，TSB液体培养基培养的菌液使用60%的甘油-20 ℃保存备用[34]。

1.3.2 DNA提取

1.3.2.1 煮沸法

采用SN/T 1632.3—2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法》第3部分：荧光PCR方法[35]，对奶粉中克罗诺杆菌属的DNA进行提取。取待测样本增菌液1 mL置于1.5 mL离心管离心，再加入100 μL PrepMan Ultra提取液于离心管中，涡旋振荡混匀30 s左右，然后100 ℃水浴10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液即为DNA模板，测其浓度后于-20 ℃保存[36]。

1.3.2.2 快提法

移取20 µL的对数期菌液到1.5 mL的离心管中，加入98 μL（ddH2O、10 μL 10×Green buffer、2 μL PrepGEM）的提取混合液混匀，将提取混合液和样本加入PDQeX试管中，在MicroGEM DNA PDQex核酸提取仪上按照操作程序：75 ℃ 10 min、95 ℃ 2 min进行温控反应，即可直接获取DNA。

1.3.3 real-time PCR

根据SN/T 1632.3—2013第3部分：荧光PCR方法[35]合成引物探针，正向引物序列为5’-GGCGAGCGGCGAATATTAT-3’，反向引物序列为5’-CGGGTTTTCCCAGTTGAGATC-3’，探针序列为5’-FAM-CACCAGTTTTCGGTGCGCCAGC-BHQ-3’。real-time PCR体系：总体积25 μL包含12.5 μL real-time PCR预混液；10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探针0.5 μL，模板DNA 5 μL，无菌ddH2O 6 μL。

1.3.4 快速real-time PCR程序优化

为建立快速real-time PCR程序，传统real-time PCR程序（50 ℃、2 min，95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，55 ℃、1 min，40 个循环），在循环数不变的情况下，对各阶段的反应时间进行优化，优化情况见表1。每个样品平行检测2 次，并进行2 次重复实验。

表1 快速real-time PCR程序Table 1 Fast real-time PCR reaction program

1.3.5 快速real-time PCR体系优化

1.3.5.1 预混液的选取

分别选1～8号酶：2×TaqMan Fast qPCR Master MIX(Low Rox)、QuantiNova Probe PCR Kit、Luna Universal Probe qPCR Master Mix、HyperProbe Mixture、GoldstarTaqMan Miture(Low Rox)、TaqMan Fast Advanced Master Mix、TaqManTMGene Expression Master Mix、SsoAdvanced Universal Probes Supermix，进行real-time PCR扩增，比较其扩增效率。每个反应平行检测2 次，并进行2 次重复实验。

1.3.5.2 预混液用量的优化

目前快速real-time PCR预混液的用量为12.5 μL，考虑到实验成本，对预混液用量进行优化。预混液的用量依次为12.5、10、8、7、6、5 μL，保持反应体系25 μL不变，预混液减少部分用ddH2O代替，进行快速real-time PCR扩增，选择最适预混液的用量。每个反应平行检测2 次，并进行2 次重复实验。

1.3.5.3 探针用量的优化

目前快速real-time PCR体系探针的用量为0.5 μL，考虑到实验成本，对探针用量进行优化。使体系探针用量依次为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 μL，保持反应体系25 μL不变，酶减少部分用ddH2O代替，进行快速real-time PCR扩增，选择最适探针用量。每个反应平行检测2 次，并进行2 次重复实验。

1.3.6 纯菌液检出限的确定

接种克罗诺杆菌属于TSB培养基中，37 ℃过夜培养。使用平板菌落计数法计数，10 倍梯度稀释菌液。分别用煮沸法和快提法提取基因组DNA，并进行快速realtime PCR扩增。用ddH2O作空白对照，每个反应平行检测2 次，并进行2 次重复实验。

1.3.7 人工污染奶粉检出限确定

在超净工作台中称取25 g新开封的某品牌婴幼儿配方奶粉1段于225 mL生理盐水中，充分振荡混匀配制成质量分数10%的均质液，即每1 g奶粉样品相当于10 mL均质液。分别接种丙二酸盐阳性克罗诺杆菌和阪崎肠杆菌于TSB培养基中，37 ℃培养8 h。使用平板计数法统计菌体浓度，取1 mL菌液用灭菌生理盐水进行10 倍梯度稀释，然后对匀浆液分别人工污染不同浓度的克罗诺杆菌属菌液，制成人工污染样品。取人工污染克罗诺杆菌属的奶粉样品提取模板DNA，进行快速real-time PCR检测，确定检出限。用ddH2O作空白对照，每个反应平行检测2 次，并进行2 次重复实验。

1.3.8 检测结果的判定

参考SN/T 1632.3—2013第3部分：荧光PCR方法[35]判断其检测结果。

1.4 数据统计及图表绘制

从仪器导出2 次重复实验的检测结果和数据，并录入在Excel表格中，在Excel中用“AVERAGE”计算平均值，选中“STDEV”计算标准偏差。根据数据绘制三线表、柱形图或散点图。为清晰展示结果，部分增加趋势线，柱形图用不同颜色和图案填充；以重复实验的标准偏差添加误差线，部分用多个图组合进行结果呈现。

2 结果与分析

2.1 快速real-time PCR程序的建立

以丙二酸盐阳性克罗诺杆菌和阪崎肠杆菌DNA为模板，对反应程序进行优化，结果如图1所示。检测时间从传统的82 min左右缩短至27 min 15 s，缩短了1 h左右。real-time PCR扩增效率显示，阪崎肠杆菌检测的Ct值仅从开始的17.34增加到18.29，丙二酸盐阳性克罗诺检测Ct值从开始的16.35反而降低到14.82。2 种菌的扩增变化均在1 个循环左右，表明建立的快速real-time PCR程序对检测结果影响不大。

图1 快速real-time PCR扩增程序的优化Fig. 1 Optimization of the fast real-time PCR amplification procedure

2.2 快速real-time PCR体系的优化

2.2.1 预混液的优化

为了筛选适用于快速real-time PCR检测程序的预混液，选取市面上常见品牌的8 种酶，以丙二酸盐阳性克罗诺杆菌和阪崎肠杆菌DNA为模板，采用上述建立的快速real-time PCR程序对8 种酶的扩增效率进行分析，扩增结果分别如图2A、B所示。并对实验结果进行数据分析（图2C），结果显示，6号酶对丙二酸盐阳性克罗诺杆菌的扩增结果最好。而对于阪崎肠杆菌，1号酶和6号酶对阪崎肠杆菌的扩增效果均较好，平均Ct值分别为17.77±0.81和18.06±0.91，结果相差不大。综合2 种菌的检测结果，选定6号酶即TaqMan Fast Advanced Master Mix作为快速real-time PCR检测的预混液。

图28 种real-time PCR预混液扩增结果分析Fig. 2 Analysis of amplification results with eight real-time PCR premixes

2.2.2 反应体系优化

影响real-time PCR检测费用的2 个主要因素是realtime PCR预混液和探针，因此为降低实验成本，对其进行体系优化。首先对预混液用量进行优化，结果（图3A）显示预混液用量为7 μL时与标准体系的扩增结果相差不大，而当预混液用量为6 μL时扩增效率显著降低。因此在保证检测结果的前提下，为降低实验成本，推荐预混液的用量为7 μL。

进一步对探针的用量进行优化，结果如图3B所示，探针用量从0.5 μL降到0.2 μL时扩增结果影响不大，因此推荐探针用量为0.2 μL。

图3 反应体系优化结果Fig. 3 Optimal conditions of the reaction system

2.3 快提法与传统煮沸法结果比较

为了快速高效地获取克罗诺杆菌的DNA，本研究通过比较后采用MicroGEM DNA提取试剂盒提取克罗诺杆菌的DNA，该方法可在直接挑取菌落或取菌液后仅通过温控反应一步法获取DNA。为了分析其检测效率，将快提法与传统煮沸法进行比较。通过平板菌落计数法计数测定丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、阪崎肠杆菌原菌液初始浓度均为108CFU/mL，进行10 倍梯度稀释后，其浓度分别为107、106、105、104、103、102、101、100CFU/mL，分别通过快提法和煮沸法提取2 种菌的DNA，并用快速real-time PCR进行检测，对实验结果进行分析，分别如图4和图5所示。

图4 丙二酸盐阳性克罗诺杆菌检测结果Fig. 4 Results of Cronobacter malonaticus detection

图5 阪崎肠杆菌检测结果Fig. 5 Results of Enterobacter sakazakii detection

结果（图4）显示，快提法和煮沸法对丙二酸盐阳性克罗诺杆菌纯菌的检测灵敏度均为104CFU/mL，人工污染样品培养1、2、3 h的灵敏度为104CFU/mL，培养4 h的灵敏度为103CFU/mL，培养5、6 h的灵敏度都为102CFU/mL，培养7 h快提法的灵敏度为102CFU/mL，煮沸法的灵敏度为101CFU/mL，培养8 h快提法的灵敏度为101CFU/mL，比煮沸法灵敏度低1 个数量级。

阪崎肠杆菌快提法和煮沸法检测结果（图5）显示，快提法和煮沸法对纯菌的检测灵敏度都为104CFU/mL，快提法对人工污染样品培养前5 h的灵敏度为104CFU/mL，煮沸法在培养0 h时检测灵敏度为105CFU/mL，培养到5 h之前灵敏度为104CFU/mL，培养6 h的灵敏度均为103CFU/mL，培养7 h灵敏度均为102CFU/mL，培养8 h快提法的灵敏度为101CFU/mL，而仅比取样量超出50 倍的煮沸法的灵敏度低1 个数量级。以上检验结果表明建立的一步法DNA提取技术检测的灵敏度几乎与传统的煮沸法等同，可以满足现场检测快速便捷的检测需求。

3 讨论与结论

丙二酸盐阳性克罗诺杆菌和阪崎肠杆菌的快提法与传统煮沸法检验结果表明，2 种方法对纯菌的检测以及人工污染样品培养前6 h可以达到同样的灵敏度，到7、8 h时，快提法的检出限较传统煮沸法低1 个数量级，分析可能是2 种方法取样量差异造成的，煮沸法取样量是快提法取样量的50 倍，导致2 种方法在检测结果上稍有偏差。虽然煮沸法灵敏度稍高于快提法，但是传统煮沸法需要离心、煮沸、再离心、去脂肪及蛋白质等步骤，整个过程需要30 min左右。而本研究建立的一步法快速提取DNA是通过使用降解能力远高于蛋白酶K的嗜热蛋白酶，提取流程仅通过取样-加液-温控反应即可完成DNA提取。这样避免了传统煮沸法的离心、沸水浴等过程，也避免了传统磁珠法/吸附柱法中吸附、洗脱、洗涤等环节反复移液操作造成的损失，在快速提取的同时保证了DNA的高收率。可在12 min左右获取目标菌株DNA，极大简化了提取步骤，提高了DNA提取效率。

目前微生物快检技术主要研究方向包括分子生物学技术、传感器技术以及光谱技术。其中分子生物学技术除了本实验涉及的real-time PCR技术外，应用较多的还有环介导等温扩增技术，该技术在未增菌的情况下，其对微生物的检出限达到103CFU/mL[37]。该技术虽然较realtime PCR技术对仪器的要求更低，但该技术需引入多条引物，对引物要求较高[36]。传感器技术主要包括光学生物传感器、电化学生物传感器以及机械生物传感器，对微生物的检出限也可达到103CFU/mL[36,38-40]。该技术检测微生物具有快速、灵敏、操作简单、对操作人员要求低等特点，但食物基质的复杂性限制了生物传感器的灵敏度和特异性，生物传感器用于识别生物分子的原件其寿命相对较短，且生产成本也比较高，所以生物传感器技术的使用受到了一定的限制，大多还处于研制阶段[41-42]。拉曼光谱及表面增强拉曼光谱技术是目前应用较多的检测微生物的光谱技术，拉曼光谱技术对微生物的检出限为103CFU/mL[43]，而表面增强拉曼光谱的检出限可达100CFU/mL[44]。该技术检测微生物具有预处理步骤简单、对菌体无损伤等优点，但其图像易受生长环境、生长状态以及标本制作过程等因素的影响，且其检测的波长，样品处理方式都不统一，因此还需要不断发展以更好的应用在微生物检测领域[45]。本实验建立的快速检测技术基于基因进行检测，受食物基质影响较小，且操作步骤快速简单、灵敏度高，结果也不需要进行电泳等步骤，具有很好的应用前景。

通过调查，发现市面上微生物的快速检测设备较少，且基本都需要长时间的前增菌培养，例如，目前应用较多的微生物快速检测系统检测10 CFU/mL的菌至少需要培养16 h[20-22]，而本研究建立的速测技术，仅培养8 h即可达到上述检出限，且从DNA提取到快速real-time PCR检测仅需40 min即可完成。同时该方法在不前增菌的情况下对克罗诺杆菌属检测的灵敏度可达104CFU/mL，而微生物快速检测系统要达到相同检测灵敏度，至少需要培养8 h，因此本研究建立的速测技术具有明显的优势。然而目前该方法也存在一些技术问题，主要是由于DNA提取管的容量小（100 μL）导致取样量太少，影响了检测的灵敏度。后期将通过加大提取管的容量，或使用滤膜、免疫磁珠等方式富集菌体提高取样量，从而提高检测的灵敏度。另外本实验所用迷你real-time PCR仪升降温速率快，可达10 ℃/s，使整个变温扩增过程所需要的时间大大减少；仅A4纸大小，方便携带；且具有固定、无运动的光学部件，长期使用或移动运输无需高昂繁琐的定期校准维护。因此本研究后期将通过组合一步法快速提取DNA技术配套迷你real-time PCR仪，形成一个便携式微生物快速检测集装箱，为小空间、口岸、现场快速检测等场景的应用提供良好的技术支撑。