注射用丹参多酚酸对大面积脑梗死患者血管新生促进作用及对脑灌注改善作用的观察研究

张 娟， 赵路清， 胡风云， 乔美玲， 马 慧

目前，注射用丹参多酚酸被广泛用于缺血性心血管疾病和脑血管疾病的治疗。研究表明，注射用丹参多酚酸可通过促进血管新生提高体外皮瓣移植的成功率[1]，且血清中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、血管生成素(Angiopoietin，Ang)也可促进血管新生[2～4]。并且，研究表明准连续式动脉自旋标记成像(pseudo-continuous arterial spin labeling，pCASL)对微血管的观察敏感[5]，且不易受其他血流的影响[6]，可更好地通过CBF定量反映脑组织灌注情况，进一步评估血管新生。据此，本研究通过比较大面积脑梗死患者治疗前、治疗后14 d血清中VEGF、bFGF、Ang的变化及pCASL磁共振成像病变脑组织感兴趣区(region of interest，ROI)脑血流量(cerebral blood flow，CBF)与对侧镜像区CBF的比值(CBF病变/CBF正常)的变化、NIHSS评分及mRS评分的变化来评估注射用丹参多酚酸对大面积脑梗死患者血管新生相关因子的调节作用，及对脑组织灌注及神经功能的改善作用。

1 对象和方法

1.1 病例选取 选取2018年5月至2019年5月于山西省人民医院住院经头部核磁确诊的大面积脑梗死(large area cerebral infarction)患者，共44例，入选标准均符合全国脑血管病学术会议修订的诊断标准及评定方法。

入组标准：年龄40～75岁；发病72 h以内的大面积脑梗死患者；首次脑血管病发病者，或曾有脑血管病病史，但未留后遗症，且不影响本次NIHSS评分，卒中发病前mRS评分≤1分；经头部核磁DWI检查示颈内动脉系统大面积脑梗死；在知情同意情况下能够接受和配合抽血检验、核磁检查。样本含量为44例。

排除标准：既往有神经系统疾病病史；既往存在较严重的高血压、糖尿病、结缔组织疾病病史，血管检查提示存在明显的动脉粥样硬化表现，尤其是已存在严重大动脉狭窄；合并严重肝肾功能异常；近期手术史；治疗过程中转入神经外科行手术治疗；存在磁共振检查禁忌证；对丹参多酚酸过敏；死亡患者。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 两组患者均给予脱水降颅压、脑保护治疗，丹参多酚酸治疗组在以上用药基础上加用注射用丹参多酚酸(天津天士力之骄药业有限公司生产，浅棕色冻干粉针，规格：每支含丹参多酚酸130 mg，批准文号为国药准字Z20110011，有效期为24 m)滴注，一日一次，一次1支(130 mg)，两组疗程均为14 d。

1.2.2 血清观察指标实验步骤及NIHSS、mRS评分 两组患者分别于治疗前、后均采集标本静脉血5 ml，将标本置于离心仪上，设置参数为3000 r/min，10 min后取上清液，将标本标号后置于-80 ℃超低温冰箱(海尔公司)保存；从密封袋中取出实验所需板条平衡至室温，未使用的板条和干燥剂放入铝箔袋内，密封口袋置于4 ℃；设置标准品孔和样本孔后依次排序，分别于标准品孔中加入不同浓度的标准品50 μl，于样本孔中按标记好的标本序号先加入标本10 ml，后加入样本稀释液40 μl，空白孔不加；除空白孔外，标准品孔和样本孔每孔中依次加入过氧化物酶标记的检测抗体100 μl，将反应孔封住，置于恒温箱孵育60 min；弃去反应孔内液体，吸水纸拍干，每孔加入洗涤液350 μl，静置1 min后弃去洗涤液，于自动洗板机上重复上述过程5次；每孔分别加入底物A、底物B各50 μl，置于恒温孵育箱15 min；每孔加入终止液50 μl，即刻将板条置于酶标仪上测量OD450值(3 min内)，在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果即获得血清VEGF、bFGF、Ang因子水平。

分别于治疗前、治疗后14 d进行NIHSS评分、mRS评分。

1.2.3 pCASL扫描及数据 采集使用八通道扫描线圈的德国西门子超导型3.0T磁共振成像系统进行射频发射。常规分别于发病72 h内的大面积脑梗死患者行T1加权像(T1-weighted imaging，T1WI)、液体衰减反转恢复序列(fluid attenuated inversion recovery，FLAIR)、弥散加权像(diffusion weighted imaging，DWI)序列扫描，于治疗前、治疗后14 d行pCASL检查，采用pCASL的标签后延迟(Post labeling delay，PLD)时间为2525 ms，取治疗前、治疗后14 d取同一层面的同一位置，且病变脑组织明显低灌注区域为ROI区，分别于病变脑组织及其镜像区域多次测量此区域不同部位CBF值，然后取其平均值即为CBF值。pCASL扫描所得的图像和数据均由山西省人民医院具有多年阅片和数据处理的医师完成。典型大面积脑梗死患者治疗前、治疗后14 d脑组织在pCASL图像上的表现见图1。

图1 大面积脑梗死患者治疗前、治疗后14 d脑组织pCASL图像

1.2.4 临床疗效评定指标

1.2.4.1 神经功能缺损程度 采用美国国立卫生院脑卒中量表(National Institutes Healthy Stroke Scales，NIHSS)进行评定，满分30分，分值越高，神经功能缺损症状越严重。

1.2.4.2 残疾状况 采用改良Rankin量表(modified Rankin Scales，mRS)进行评定，患者评分0～2分判定为独立，3～5分判定为残疾。评分均由山西省人民医院神经内科具有检查资质的人员进行，且保证检查人员的固定、检查场所的安静、私密。

1.2.5 药物毒性作用观察指标 观察两组患者在治疗前、后及治疗过程中肝肾功能、凝血功能、血细胞分析及有无皮疹等过敏反应及其他不良事件。以上血液观察指标均由山西省人民检验科应用统一仪器检验。

2 结 果

按照入组标准共入选44例大面积脑梗死患者，其中3例因病情变化变化转入神经外科手术治疗，1例因死亡脱离，最终参与结果分析患者为丹参多酚酸治疗组和对照组各20例，共40例。

2.1 基线资料比较 将两组患者年龄、性别及高血压、糖尿病患病率进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)；比较两组患者治疗前血清Ang、bFGF、VEGF水平，无统计学差异(P>0.05)；两组患者治疗前CBF病变/CBF正常水平，无统计学差异(P>0.05)；两组患者治疗前NIHSS评分、mRS评分比较，无统计学差异(P>0.05)(见表 1)。

表1 两组患者基线资料比较

2.2 两组患者治疗前、后血清Ang、bFGF、VEGF水平的比较 两组患者治疗前、治疗后14 d血清Ang、bFGF、VEGF水平比较，丹参多酚酸治疗组有统计学差异(P<0.05)，对照组血清VEGF有统计学差异(P<0.05)(见表2)。

表2 两组患者治疗前、后血清Ang、bFGF、VEGF水平差值的比较(pg/ml)

2.3 两组患者治疗后14 d血清Ang、bFGF、VEGF水平的比较 两组患者治疗后14 d血清Ang、bFGF、VEGF水平比较，有统计学差异(P<0.05)，丹参多酚酸治疗组Ang、bFGF、VEGF水平较对照组明显升高(P<0.05)(见表3)。

表3 两组患者治疗后14 d血清Ang、bFGF、VEGF水平的比较(pg/ml)

2.4 两组患者治疗前、后CBF病变/CBF正常水平的比较 两组患者治疗前、后14 d CBF病变/CBF正常水平比较，有统计学差异(P<0.05)(见表4)。

表4 两组患者治疗前、后CBF病变/CBF正常水平差值的比较

2.5 两组患者治疗后14 d CBF病变/CBF正常水平、NIHSS、mRS评分的比较 两组患者治疗后14 d CBF病变/CBF正常水平、NIHSS、mRS评分比较，有统计学差异(P<0.05)，丹参多酚酸治疗组CBF病变/CBF正常水平较对照组明显升高(P<0.05)，丹参多酚酸治疗组NIHSS、mRS评分较对照组下降明显(P<0.05)(见表5)。

表5 两组患者治疗后14 d CBF病变/CBF正常水平的比较

2.6 不良反应 两组患者治疗前后及治疗过程中均未见明显药物相关性肝肾功能损害，未见明显药物相关性凝血功能及血常规异常，且无明显皮疹出现。

3 讨 论

脑梗死的侧支循环分为三级，在缺血早期即可形成且发挥代偿作用的为一级侧支循环即脑底的Willis环，二级侧支循环为眼动脉、软脑膜吻合支以及其他颅内外动脉分支的吻合，三级侧支循环形成时间最长，为新生血管的形成，是最终的侧支代偿途径。而新生血管较难以用肉眼及常规检查项目直接观察，因此，如何能够更好的观察新生血管的情况显得尤为重要。

近年来，新生血管的形成及成熟程度已成为治疗的重要目标，并且会直接影响组织的灌注及代谢。研究表明，Ang、bFGF、VEGF均可促进血管新生[2～4]。

Ang-Tie系统是近期发现的维持血管内皮细胞稳态的一个特定系统，对正常血管发育以及血管生成至关重要[7]。其中，Ang 是一个分泌糖蛋白配体家族，主要作用于血管，以控制血管发育和稳定[8]，其包括C端的FReD(fibrinogen-related domain)和N-terminus的超级聚类区域(superclustering region)[9]，通过C端FReD 中的P 域与Tie受体结合[ 10]。炎症和缺氧刺激均可增加Ang-2表达，也可促进血管内皮活化、降低血管稳定性，以促进新血管生成和重塑[11]。相反，Ang-1主要在血管生成后，可通过抑制组织纤维化促进血管稳定性、调解血管正常化[12]。因此，Ang-Tie系统可以促进血管新生。

bFGF是一种血管生长因子和活性肽，通过将囊泡释放到细胞间空间进行信号转导，促进血管生成自体效应[13]。bFGF可通过与成纤维因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)的相互作用，介导FGFR二聚化、磷酸化和信号通路的激活，如Ras-MAPK和PIK-3通路，进而激活FGF/FGFR轴从而增加血管生成潜力促进血管新生[14]，也可以通过促进血管再生、血管网的建立，进而促进缺血半暗带的血管再生，改善脑梗死区血液供应，改善脑梗死患者的治疗效果和预后[3]。并且，Tanaka等也提出bFGF可以提供缺血半暗带的血流量进而提高治疗效果[15]。

VEGF作为内皮细胞增殖、入侵和迁移的繁殖因子和刺激因素促进血管新生[4]。VEGF通过激活PI3K-Akt通路和对抗凋亡蛋白如Bcl-2的调节来增强内皮细胞存活率[16]，还可通过激活Erk1/2信号和内皮细胞迁移、激活焦点粘附激酶(FAK)以及诱导若干细胞外基质降解蛋白，包括金属蛋白酶、尿激酶型质原活原活化剂(uPA)和组织型质原活化剂(TTPA)调节内皮细胞的增殖促进血管新生[17]。

本研究显示，排除年龄、性别、高血压、糖尿病因素对血清Ang、bFGF、VEGF的影响，丹参多酚酸治疗组和对照组均可使血清Ang、bFGF、VEGF水平升高(P<0.05)，且丹参多酚酸治疗组较对照组患者血清Ang、bFGF、VEGF水平升高更显著。导致这一结果的原因可能为在缺血缺氧状态下，注射用丹参多酚酸通过C端的FReD中的P域与Tie受体结合进而对Ang-Tie系统中的Ang-1、Ang-2产生调节作用，且缺氧刺激增加Ang-2表达，其可促进血管内皮活化、降低血管稳定性，进而促进新血管生成和重塑[6]，同时可通过诱导平滑肌细胞和内皮细胞以及与血清VEGF相互作用使血清中Ang升高；通过将释放囊泡至细胞空间激活信号通路进而发挥作用使血清中bFGF升高，bFGF可通过与成纤维因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)的相互作用，进而激活FGF/FGFR轴从而增加血管生成潜力促进血管新生[14]；VEGF可通过作用于PI3K-Akt通路、激活Erk1/2信号通路、激活焦点粘附激酶(FAK)以及诱导若干细胞外基质降解蛋白等多种方式刺激内皮细胞的增殖，VEGF进一步作为内皮细胞的繁殖因子和刺激因素促进血管新生[16]。并且研究表明，注射用丹参多酚酸的主要成分丹酚酸B也作用于STAT3/VEGF信号通路调节信号传感器和活化剂转录3(STAT3)磷酸化蛋白表达促进VEGF升高[18]。

CBF是体现大脑功能和新陈代谢的一个生理参数[19]，也是研究脑组织处于正常或疾病状态的一个基本参数[20]。因此，CBF被广泛用于评估脑组织的功能，尤其是被用于评估脑疾病治疗的有效性[21]。目前有各种CBF定量测量方法，Detre等[22]于1992年首次报告了一种非侵入核磁灌注技术即动脉自旋标签(arterial spin labeling，ASL)，它是一种以动脉水作为内源性示踪剂，可以生成CBF的绝对测量值及CBF的脑血流量地形图，而且适合跟踪由于恢复或治疗干预而随时间变化而变化的多项研究[23]。其中pCASL是一种可以对特定时刻脑血流量CBF进行体内准确测量，且可以通过设置多个PLD来测量多个时刻灌注水平的一种核磁技术[24]，因此本研究采用测量pCASL的CBF值来评估脑组织的灌注情况。

目前研究表明，pCASL对微血管状态敏感[5]，可更好的观察侧支循环，且对于脑疾病临床症状出现之前和脑组织灌注发生异常的最初阶段也同样敏感[25]。pCASL通过监测脑血流量已被应用于脑血管疾病、脑肿瘤的分级、阿尔茨海默病(AD)、癫痫、帕金森疾病严重程度的分级等[26～28]。CBF降低，可作为神经元退化的早期标志[29]，通过使b-淀粉样蛋白升高和毛细血管低灌注[30]，导致神经元功能障碍。本研究显示，通过pCASL检测的丹参多酚酸治疗组ROI区CBF病变/CBF正常值升高较对照组显著，可能与注射用丹参多酚酸促进侧支循环形成有关。

本研究显示，丹参多酚酸治疗组与对照组均可使NIHSS评分、mRS评分较治疗前下降(P<0.05)，且丹参多酚酸治疗组较对照组下降显著。导致这一结果的原因可能不仅与注射用丹参多酚酸可促进血管新生形成三级侧支循环，改善脑灌注相关，而且还与其神经元保护、清楚自由基、抗氧化等作用有关。总之，注射用丹参多酚酸可通过改善脑组织灌注、保护神经元、清楚自由基等作用改善神经功能。

综上所述，注射用丹参多酚酸对大面积脑梗死患者血清血管新生相关因子具有一定的调节作用，进而通过血管新生改善脑组织灌注，进一步改善患者神经功能缺损症状，且研究表明注射用丹参多酚酸具有保护神经元、抗氧化、抗炎、稳定线粒体内膜等多种功能，可通过拯救缺血半暗带、挽救神经元及神经细胞，改善大面积脑梗死患者预后。本研究提示我们，可通过早期监测患者血清中血管新生相关因子的浓度，联合pCASL监测脑组织灌注情况，从而间接评估侧支循环情况，进一步评估大面积脑梗死患者的预后。