60Coγ射线对HaCaT细胞损伤的模型建立及其机制

黄从书 朱贵花 刘桂芳 谢光辉 马增春 高 月

1（广东药科大学 广州 510006）

2（江西中医药大学 南昌 330004）

3（军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所 北京 100850）

放射性皮肤损伤是指全身或局部受到一定剂量的某种射线照射后所产生的皮肤损伤，具有潜伏性、迁延性、反复性和难愈性等特点。放射单独治疗或作为手术的辅助治疗是头颈癌、皮肤癌、肛门癌和乳腺癌最有效的治疗方法之一，但常见的副作用，皮肤损伤，限制了其更广泛的应用［1］。

皮肤作为机体抵御外界刺激的第一道防线，对于机体保护具有重要意义，人皮肤角质形成细胞（Human keratinocytes，HaCaT）是皮肤表皮层中的主要细胞类型，约占表皮细胞总数的95%，是表皮的主要构成细胞［2］。HaCaT细胞是一种自发永生的人类角质形成细胞系，已被广泛用于皮肤生物学和分化研究，它不仅有物理性保护屏障作用，而且还参与免疫、炎症、肿瘤转化等多种细胞生物学过程，可以很好模拟皮肤细胞的生理病理过程［3］。因此HaCaT细胞适宜于作为建立放射性皮肤损伤的细胞模型。

有研究表明，放射性皮肤损伤的病理效应是由于基底层和真皮层的干细胞和祖细胞的损失以及通过各种炎症介质导致炎症过程的多细胞相互作用造成的，但是其损伤的机理仍不清楚［4］。目前的研究多以临床实际病例为主，个体化差异性大，无法进行长期实验，治疗药物匮乏，无特效药物和救治标准［5］。目前关于放射性皮肤损伤的细胞生物学研究和分子生物学研究进展缓慢，细胞模型构建研究较少。因此，建立有效的细胞模型，研究放射性皮肤损伤的发生发展机制，具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂

DMEM/F12培养基、磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered salinne，PBS）、青链霉素混合液（Penicillin-streptomycin solution）（Gibco，美国）；胎牛血清（四季青，杭州）；Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、β-actin抗体（CST，美国）；凋亡检测试剂盒、CCK-8试剂盒、SOD试剂盒（北仁化学，日本）；MDA试剂盒（南京建成）。

1.2 仪器与放射源

流式细胞仪（美国BD公司）；显影仪（Image Quant Las500型，Health care，瑞典）；酶标仪（PE Victor型，PerkinElmer，美国）；电泳仪、电泳槽、转膜仪（BIO-RAD，美国）。60Coγ射线照射源为军事医学研究院辐射医学研究所提供，单次吸收剂量率为100.68 cGy/min。

1.3 方法

1.3.1细胞培养

HaCaT由军事医学研究院周文霞教授实验室惠赠。HaCaT细胞在含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM/F12完全培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下的培养箱内培养。观察细胞贴壁情况，每天换一次液，每3 d传一次代。

1.3.2观察细胞形态学改变

将HaCaT细胞按照1×105mL−1的浓度接种到50 mL的培养瓶中，每瓶细胞5×105个。培养过夜后，以0 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy、24 Gy吸收剂量进行照射，在照后6 h、24 h、48 h进行形态学观察。

1.3.3CCK-8法检测HaCaT细胞活力

将处于对数生长期的HaCaT细胞进行消化，调整细胞浓度至1×105mL−1，以每孔100μL接种于96孔板中培养，待80%细胞贴壁后进行实验。根据预实验结果和吸收剂量不同，将HaCaT细胞分为0 Gy、6 Gy、12 Gy、18 Gy、24 Gy剂量组，每组设6个复孔，进行60Coγ射线照射，照射后分别培养6 h、24 h、48 h，同时设置空白对照组。在相应培养时间结束后，每孔加入10μL CCK-8试剂，37℃、5%CO2培养箱培养4 h后，酶标仪测定450 nm处的吸光度值，计算不同吸收剂量后不同孵育时间HaCaT细胞的活力改变，见式（1）。每组实验均独立重复至少3次。

式中：C为细胞活力，%；As为含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质的实验孔的吸光度值；Ac为含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测物质的对照孔的吸光度值；Ab为不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8的空白孔的吸光度值。

1.3.4脂质氧化(MDA)检测

用细胞刮刀收集依据1.3.2节中培养照射过后不同时间段的HaCaT细胞，处理细胞样本，根据MDA检测试剂盒步骤检测脂质氧化水平。根据标准曲线计算出样品中MDA含量。

1.3.5超氧化物歧化酶(SOD)活力检测

用细胞刮刀收集依据1.3.2节中培养照射过后不同时间段的HaCaT细胞，处理细胞，根据SOD检测试剂盒步骤检测SOD抑制率，得出相应SOD活力变化，见式（2）。

式中：Y为SOD抑制率，%；Aa为不含抑制剂的空白对照的吸光度值；Ab为样品空白对照的吸光度值；Ac为试剂空白对照的吸光度值；Ax为不同待测样品的吸光度值。

1.3.6流式细胞术检测细胞凋亡

将HaCaT细胞依照1.3.2节处理细胞后，吸取培养瓶中的上清液到15 mL离心管中保存，用PBS洗细胞两次并收集清洗液，用不含EDTA的胰酶消化细胞，将细胞液、上清液和清洗液一并加入15 mL离心管，1 000 r/min离心3 min，弃上清液，重复一次，依次加入检测凋亡试剂，1 h内检测。

1.3.7Western blot检测相关蛋白表达

将HaCaT细胞照射6 Gy、12 Gy、18 Gy、24 Gy吸收剂量后，培养24 h，提取细胞总蛋白，检测Caspase-3、Bax、Bcl-2凋 亡 蛋 白 和NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18炎症因子蛋白表达的变化情况。按照BCA试剂盒说明书对提取的全蛋白进行蛋白定量，每个样孔加入20μg蛋白样品，以10%SDS-PAGE进行电泳，湿法转至PVDF膜后，用含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭3 h，选择对应的一抗4℃孵育过夜，洗膜后加入对应的二抗，室温孵育1 h，再次洗膜后用化学发光法检测法（ECL）显影。以β-肌动蛋白（β-actin）和GAPDH作为内参，采用Image J图像分析软件对蛋白条带进行分析。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 HaCaT细胞细胞形态

与未照射组相对比，随着吸收剂量的增大和培养时间的延长，HaCaT细胞数量减少，细胞形态发生明显变化，细胞体积变小，发生皱缩变形，细胞间黏附降低（图1）。照后48 h，细胞变化差异变小，可能与其损伤修复有关。

图1 60Coγ射线照射后的HaCaT细胞形态学变化(100×)Fig.1 Morphological changes of HaCaT cells after 60Coγ-ray irradiation(uncolored 100×)

2.2 60Coγ射线照射对HaCaT细胞活力的影响

60Coγ射线会对HaCaT细胞造成损伤，从而影响细胞活力。与对照组相比，随着吸收剂量的增加，细胞活力降低，细胞的损伤加重（图2）。当吸收剂量为18 Gy时，在照射细胞后24 h，与对照组相比，HaCaT活力下降至57.50%，降低显著，能够作为检测药物对其损伤逆转的重要指标，因此该吸收剂量和培养时间适宜作为放射性皮肤损伤HaCaT细胞模型的条件。

图2 60Coγ射线照射后的HaCaT细胞活力变化(与对照组比较，*,#,&p＜0.05,**,##,&&p＜0.01,***,###,&&&p＜0.001,±s,n=6)Fig.2 Cell viability changes of HaCaT cells after 60Coγ-ray irradiation(compared with the control group,*,#,&p＜0.05,**,##,&&p＜0.01,***,###,&&&p＜0.001,±s,n=6)

2.3 60Coγ射线对MDA含量和SOD活性影响

随着吸收剂量的增加，细胞内氧化还原平衡被打破，与对照组相比，超氧化物歧化酶MDA含量升高，且随着SOD抑制率升高，活性降低，细胞出现氧化损伤明显（图3）。

图3 HaCaT细胞在照射不同吸收剂量24 h后MDA和SOD水平的变化：(a)SOD抑制率；(b)HaCaT细胞中MDA含量（与对照组比较，*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,±s,n=3）Fig.3 Changes of MDA and SOD levels in HaCaT cells after 24 h of different absorbed doses:(a)SOD inhibition rate;(b)MDAcontent of HaCaT cells(compared with the control group,*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,±s,n=3)

2.4 60Coγ射线对HaCaT细胞凋亡的影响

随着吸收剂量的增加，与对照组相比，细胞凋亡率升高，我们研究了60Coγ射线对HaCaT细胞凋亡通路的影响，与对照组相比Caspase-3蛋白酶表达增加，B淋巴细胞瘤-2基因家族中Bax表达增加，Bcl-2表达降低（图4）。60Coγ射线对HaCaT细胞的损伤与凋亡相关。

图4 60Coγ射线照射后24 h HaCaT细胞凋亡率及相关凋亡蛋白表达变化：(a)HaCaT细胞凋亡率变化；(b)HaCaT细胞凋亡相关蛋白的变化（与对照组比较，*,#,&p＜0.05,**,##,&&p＜0.01,***,###,&&&p＜0.001)Fig.4 Changes of HaCaT apoptosis rate and related apoptotic proteins expression after 24 h 60Coγ-ray irradiation:(a)changes of apoptosis rate in HaCaT cells;(b)changes of HaCaT apoptosis related proteins(compared with the control group,*,#,&p＜0.05,**,##,&&p＜0.01,***,###,&&&p＜0.001)

2.5 60Coγ射线致HaCaT细胞炎症

随着吸收剂量的增加，造成异常的炎症因子释放。NLRP3炎症小体被激活炎性因子表达增加，我们研究了60Coγ射线对HaCaT细胞NLRP3炎性通路的影响，60Coγ射线照射HaCaT细胞，使NLRP3激活Caspase-1，使IL-1β和IL-18表达增加，发生炎症损伤（图5）。

图5 60Coγ射线照射后24 h HaCaT细胞炎性因子相关蛋白表达变化（与对照组比较，*，#，&p＜0.05,**，##，&&p＜0.01,***，###，&&&p＜0.001）（±s,n≥3）Fig.5 Changes of inflammatory factor related protein expression in HaCaT cells after 24 h 60Coγ-ray irradiation（compared with the control group,*，#，&p＜0.05,**，##，&&p＜0.01,***，###，&&&p＜0.001）（±s,n≥3）

3 讨论

放疗作为肿瘤治疗中常规治疗方法，在临床上约有95%的患者会出现放射性皮肤损伤的不良反应［6］，但是除了保守治疗外，目前还没有有效的预防措施或治疗放射性皮肤损伤的方法［7-8］。因此，建立放射性皮肤损伤的细胞模型，在细胞分子水平探究其损伤机制具有重大意义。

急性辐射暴露后扰乱了细胞分裂和再生的正常过程，导致细胞损伤或死亡［9］，包括内皮细胞减少和炎症、表皮细胞的死亡［10］。氧化应激与急性辐射暴露后的皮肤损伤关系密切，氧化应激是指细胞内活性氧水平升高，导致脂质、蛋白质和DNA受损的应激状态，是细胞损伤和应激反应信号的结合［11］。当60Coγ射线照射皮肤时，会诱导ROS产生，为阻止ROS的生成或中和ROS，SOD被活化，进而对抗细胞氧化毒性，维持皮肤的氧化还原平衡［12］。随着吸收剂量的增加，氧化还原平衡被打破，脂质氧化终产物MDA增加，造成皮肤的发生氧化损伤。放射性皮肤损伤的氧化损伤机制可能与60Coγ射线照射皮肤后诱导产生大量ROS，从而激活JNK及p38MAPK通路，使ERK1/2、JNK及p38MAPK转移至细胞核中，激活活化蛋白（AP）-1并上调环氧合酶（COX）-2基因的表达，进一步促进了免疫抑制、炎症损伤反应，阻滞皮肤细胞增殖、分化及血管生成等过程［13］。

凋亡在维持角质形成细胞增殖平衡中具有关键作用，无论是细胞分裂增殖异常，还是细胞凋亡被抑制或失控均会引起细胞动力学改变，诱发皮肤病的产生［14］。60Coγ射线照射后会促使HaCaT细胞的ROS升高，使p38MAPK磷酸化的同时，又可促进凋亡蛋白Bax及p53表达上调，抗凋亡蛋白Blc-2表达下调［15］。促凋亡蛋白由细胞质转入线粒体，细胞色素C释放，激活下游效应器Caspase-3，使细胞功能出现障碍，凋亡小体形成，最终导致细胞凋亡［16］。Bcl-2家族中，Bax是促凋亡因子和Bcl-2抗凋亡因子，Bax升高，Bcl-2降低时，促进细胞凋亡，Bcl-2可能抑制Caspase-3活化而发挥抑凋亡作用。Bcl-2家族在皮肤癌的发生中具有重要作用［17-18］。实验证实，与对照组相比，照射后的HaCaT细胞中，Casepse-3表达显著升高，Bax升高，而Bcl-2表达则降低。辐照可导致HaCaT细胞发生凋亡，形成不可逆的程序性死亡。

机体的免疫系统被外源性刺激激活时，会促使异常的炎性因子的释放，引发炎性反应［19］。外源性刺激，会激活NLRP3炎症小体并促进其组装，进一步激活可自身催化的Caspase-1，并将pro-IL-1β和pro-IL-18加工为IL-1β和IL-18，使NLRP3炎症小体及其下游因子表达增加，从而介导炎症反应［20-21］。在照射后的HaCaT细胞中，NLRP3炎症小体及其下游因子表达增加，从而导致炎症反应。由NLRP3炎症小体介导的炎症反应在放射性皮肤损伤中具有重要作用。

HaCaT细胞在受到吸收剂量为18 Gy的60Coγ射线照射后24 h，细胞的形态发生显著改变，细胞活性降低，凋亡率升高，细胞损伤显著，适宜作为建立放射性皮肤损伤的HaCaT细胞损伤模型的条件。探究放射性皮肤损伤细胞模型中氧化、凋亡、炎症损伤的机制，为研究放射性皮肤损伤的发生、发展及抗辐射药物的研发奠定基础。但是辐射导致皮肤损伤的发生发展机制复杂，还需要进一步探索，完善其损伤机制研究。