长期1.8 GHz电磁辐射对大鼠学习认知能力的影响

高 蒙 彭怀禹 王向晖 齐红新 侯毅然 童嘉锴 张 杰

（华东师范大学物理与电子科学学院生物物理实验室 上海 200241）

中国互联网络信息中心（CNNIC）发布第45次《中国互联网络发展状况统计报告》，报告称截至2020年3月，我国网民规模达9.40亿，其中使用手机上网的人数占比达99.30%［1］。可见移动电话在生活中越来越普及，而人们暴露于移动电话、手机基站等产生的电磁辐射的时间和强度也随之增加。研究表明，即使在低暴露剂量下，电磁辐射也能产生一些生物效应［2-4］。由于人类大脑在青春期早期就可以达到最大脑容量［5-6］，而处于青春期的大脑部分重要区域（海马、杏仁核、前额叶等）对电磁辐射更加敏感［7］，因此人们对长期暴露于低剂量电磁场环境中的青少年大脑发育和学习记忆能力是否会受到影响产生了担忧。为此，学者们在动物水平开展了一系列电磁辐射对大脑神经系统及学习记忆能力影响的研究。研究表明，连续15 d低场强射频辐射（功率密度1 500μW/cm2，2 h/d）可导致幼年大鼠联合型学习记忆能力下降，引起前额叶内神经递质代谢紊乱［8］。2 000μW/cm2电磁辐射可以降低大鼠海马组织NR1蛋白及其mRNA的表达，导致大鼠学习记忆能力下降［9］。2.45 GHz微波辐射大鼠28 d（1 h/d）和计算机显示器的阴极射线管辐照小鼠（电场强度0.9 V/m，功率密度0.22μW/cm2，18 h/d），结果都显示长时间电磁辐射会扰乱生物体海马组织胆碱能系统，并对其相关标志物水平产生影响［10-11］。这些研究为电磁辐射的安全标准制定和防护提供了实验依据。然而，这些实验多是对固定体位的动物进行单频周期重复性地辐照，与自由体位、复杂组合暴露环境以及全天不间断暴露的实际情况有一定的差异。

为能够更加真实地模拟实际生活中的电磁环境，我们构建了一个能够长期全天候不间断辐照且大鼠能在鼠笼中自由活动的辐照平台，用于研究白天8 h工作时间处于职业暴露状态，其余16 h处于公众暴露状态条件下，长期暴露对发育期SD大鼠大脑组织及认知能力的影响，以期为环境暴露安全标准的制定提供更全面的实验数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

乙酰胆碱（Ach）、乙酰胆碱转移酶（ChAT）、胆碱酯酶（AChE）、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和脑源性神经生长因子（BDNF）化学试剂盒、二辛可宁酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒均购自南京建成生物有限公司；苏木精-伊红（HE）染色液购自南昌雨露实验有限公司。

Labsystems Finnpipette 100μL单道移液器；Thermo 50μL 8道移液器；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；DG5033A酶标仪（南京华东电子集团医疗装备有限责任公司）；RM2015石蜡切片机（Leica，德国）；DMi8光学显微镜（Leica，德国）。

1.2 辐照装置与动物分组

辐照装置：微波暗室（上海雅驰实业有限公司），4 m×2.5 m×2.5 m，被分隔成两间，一间作为辐照室，另一间作为假辐照室；1.8 GHz微波发射源，功率可调，可通过Wifi无线网进行剂量的远程控制，以确保大鼠在整个辐照期间不受打扰且电磁暴露剂量（SAR，W/kg）维持恒定。

雄性SD大鼠（3周龄）由华东师范大学实验动物中心提供。实验经华东师范大学动物伦理中心批准进行（伦理审查编号：R20141002）。在接受辐照前进行一周的适应实验，保证动物能够适应环境。然后将108只SD大鼠随机分为对照组（Control，n=36）、假辐照组（Sham，n=36）和辐照组（EMF，n=36）。其中，Control组饲养于辐照暗室外的房间内，EMF组、Sham组分别饲养于上述暗室的两间内，且保证均处于受控的环境中（温度（25±2）℃，湿度（50±5）%，模拟昼夜情况，9：00-21：00开灯，其余时间处于黑暗状态）。EMF组每天9：00-17：00暴露于职业接触限值（0.40 W/kg）的电磁辐射，其余时间暴露于公众接触限值0.08 W/kg（国际非电离辐射防护委员会针对热效应制定的的安全标准（ICNRP，2010））［12］。整个辐照过程持续4周，每隔3 d对大鼠进行一次体重称量（为调整入射功率提供数据），并检查其健康情况和设备的工作情况。考虑大鼠体重变化会显著影响其对电磁能量的吸收，为确保全身平均SAR值稳定在0.40 W/kg和0.08 W/kg，微波源发射功率也需随之进行不断地调整。

1.3 样品制备及测试方法

1.3.1样品制备

取样时间为辐照结束后次日9点，SD大鼠根据体重给予相应剂量的戊巴比妥钠进行深度麻醉，处死，断头取脑。在冰上迅速分离海马组织，一部分按质量（g）׃体积（mL）=1׃9加入4℃生理盐水，用于后续生化指标的检测；另一部分用4%多聚甲醛溶液进行固定，用于后续组织切片观察。

1.3.2海马胆碱能标志物水平检测

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测SD大鼠海马组织中的总蛋白浓度。严格按照南京建成生物有限公司试剂盒ACh、ChAT、AChE的操作方法进行检测，使用酶标仪检测各管吸光度值，利用蒸馏水调零。

1.3.3海马组织内单胺类神经递质、氧化应激指标水平检测

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测SD大鼠海马组织中的总蛋白浓度。严格按照南京建成生物有限公司试剂盒DA、NE、5-HT、BDNF和SOD、MDA的操作方法进行检测，使用酶标仪检测各管吸光值，根据标准曲线得出结果。

1.3.4海马组织形态学观察

4%多聚甲醛溶液固定后的海马组织经脱水、石蜡包埋切片（5μm）后，再进行HE染色，最后在显微镜下观察大鼠海马组织形态。

1.4 Morris水迷宫实验

辐照结束后立即进行为期一周的Morris水迷宫实验，用于评估电磁暴露对SD大鼠学习记忆能力的影响［13-14］。将大鼠头朝下，紧贴池壁轻放入水中，随机选取放入位置，可以取0°、90°、180°、360°的角为起始位置，开始60 s的引导实验，如果大鼠在60 s内找不到平台则引导大鼠到达平台，并在平台上停留20 s。每只每天训练4次，每次训练时间间隔为15～20 min，连续训练5 d。训练结束后2 d撤除平台，将动物由原先的4个位置放入水中，记录动物在水中的活动轨迹、进入平台位置所花的时间及撤掉平台后大鼠进入平台范围内的次数，以此作为空间记忆的检测指标。

1.5 数据分析

使用IBM SPSS statistics 23软件对实验数据进行统计分析，结果以±s形式表示，p＜0.05视为具有显著性差异，具有统计学意义。由于Control组与Sham组无显著性差异，所以有关结果均对Sham组进行归一。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与Sham组进行比较。

2 结果

2.1 大鼠海马内氧化应激指标水平变化及组织形态观察

图1（a）是SD大鼠脑组织中氧化应激指标SOD活性的检测结果，图1（b）是氧化应激产物MDA含量的检测结果。从图1可以看出，辐照后0 d大鼠海马组织内的SOD活性和MDA含量在辐照后无显著性变化，SOD是自由基清除酶，MDA是氧化应激的产物，这说明体内无多余氧自由基形成，未产生氧化应激反应。

图1 氧化应激相关指标(n=6)：(a)大鼠海马的SOD活性(p＜0.05)；（b）大鼠海马的MDA含量Fig.1 Oxidative stress-related indicators(n=6):(a)SOD activity in rats'hippocampus(p＜0.05);(b)Content of MDA in rats'hippocampus

图2为HE染色的大鼠海马组织。由图2可以观察到，Control组、Sham组与EMF组海马组织形态均正常，EMF组DG区神经元结构排列紧密，颗粒细胞呈圆形或卵圆形，核内染色质分布均匀，CA1区的锥体细胞均为3～4层，且排列整齐致密，胞核饱满，边界清晰，较对照无明显差异。结果表明，本辐照条件下，大鼠的海马组织形态未受到损伤，且未产生氧化应激反应。

图2 HE染色的大鼠海马组织(40×)：(a)Control组的CA1区；(b)Sham组的CA1区；(c)EMF组CA1区；(d)Control组的DG区；(e)Sham组的DG区；(f)EMF组的DG区Fig.2 Rats'hippocampal tissue at HE stained(40×):(a)CA1 in Control group;(b)CA1 in Sham group;(c)CA1 in EMF group;(d)DG in Control group;(e)DG in Sham group;(f)DG in EMF group

2.2 辐照后大鼠海马胆碱能、单胺类神经递质标志物水平的变化

图3是辐照后0 d、7 d、14 d SD大鼠脑组织中海马胆碱能标志物Ach含量、AChE活性和ChAT活性的检测结果。

图3 0 d、7 d、14 d大鼠海马组织内Ach、AChE和ChAT相对水平变化；*p＜0.05，与Sham组比较；n=6Fig.3 Changes in the relative levels of Ach,AChE,and ChAT in the hippocampus of rats at 0 d,7 d,and 14 d;*p＜0.05,compared with the Sham group;n=6

Ach由胆碱在ChAT的催化作用下合成，最后被AChE水解成胆碱和醋酸，ChAT和AChE共同维持着Ach的动态平衡，它的含量与大脑记忆能力强弱有关。如图3所示，辐照结束后，Ach含量与ChAT活性较Sham组显著性上升，有一定的上调趋势，与Sham组相比，具有显著性差异；而AChE活性与Sham组相比，则显著性下降。第7天与第0天相似，在第14天Ach含量、ChAT活性和AChE活性基本恢复，这说明低剂量长期辐射会引起胆碱能系统紊乱，但这种损伤是可恢复的。

图4是辐照后0 d、7 d、14 d SD大鼠脑组织中神经递质DA、NE、5-HT以及营养因子BDNF含量的检测结果。5-HT对大脑发育以及情绪调节至关重要，辐照后，大鼠的神经递质5-HT与DA含量呈显著性升高趋势，这会影响大鼠认知灵活性。NE与BDNF在辐照后与Sham组相比无显著性差异。BDNF在神经元生长发育和修复损伤过程中发挥重要的作用，在辐照后第7天，BDNF含量与第0天相比有一定的升高，这说明在第7天，神经递质水平可能进入恢复状态。DA与BDNF含量与Sham组相比具有显著性差异，5-HT与NE无显著性变化。在辐照后14 d，各神经递质含量与Sham组相比无显著性差异，说明该辐照条件对生物体造成的损伤并非是永久性的，神经递质水平都基本恢复正常。

图4 0 d、7 d、14 d大鼠海马组织内神经递质水平；*p＜0.05，与Sham组比较；n=6Fig.4 Neurotransmitter levels in hippocampus of rats at 0 d,7 d,and 14 d;*p＜0.05,compared with the Sham group;n=6

2.3 Morris水迷宫实验

图5是训练期大鼠的逃避潜伏期时长随训练天数的变化情况，逃避潜伏期时长与大鼠学习记忆能力有关。如图5，Control组、Sham组和EMF组大鼠的逃避潜伏期时长均随着训练天数的增加而减小，在照后2 d、3 d、4 d EMF组的逃避潜伏期时长虽然有略高于其余两组的趋势，但在多次训练后EMF组的训练结果与其余两组无显著性差异，说明本实验条件下，长期低剂量电磁辐射未对大鼠学习记忆能力产生显著性影响。

图5 每天训练4次的大鼠潜伏期随训练天数的变化情况(n=18)Fig.5 Changes of incubation period with training days in rats trained four times a day(n=18)

在训练阶段结束后撤去水下平台进行空间探索实验，记录大鼠穿越平台的次数、在原平台所在象限（目标象限）停留的时间（持续时间）、航行路程占比（目标象限路程/总路程），其结果如表1所示。EMF组的各项指标与Sham组、Control组相比均无显著性差异。说明本实验条件未对大鼠学习记忆能力产生显著性影响。

表1 大鼠空间学习记忆能力的测试结果Table 1 Results of spatial learning and memory ability in rats during examination stage (n=18)

3 讨论

根据文献报道，射频电磁辐射主要通过氧化应激反应来对神经系统造成损害［15］，在正常的代谢过程中，体内会不断地产生自由基，因此也会存在自由基清除酶，使之达到动态平衡。SOD是一种自由基清除酶，而MDA是氧化应激的产物，本研究中SD大鼠海马组织内的SOD活性与MDA含量辐照前后无显著性差异，这揭示了1.8 GHz组合电磁辐射对SD大鼠未造成显著的氧化应激损伤。与之相应地，也没有观察到大鼠海马组织形态的异常，说明本实验辐照条件下，大鼠脑部海马组织没有受到损伤。

学习和记忆是脑的高级功能，海马是学习记忆的重要脑区，含有丰富的胆碱能纤维［16］，也是容易受到电磁辐射影响的区域。脑中重要的胆碱能标志物主要包括Ach、AChE和ChAT，这与大脑的学习认知能力密不可分。其中Ach与脑功能最为密切，Ach由胆碱在ChAT的催化作用下合成，通过乙酰胆碱转运体转运到突触囊泡，从突触囊泡释放后被AChE水解成胆碱和醋酸，ChAT和AChE共同维持着Ach的动态平衡，从而确保胆碱能系统的稳定。本辐照条件会引起海马中Ach含量的增加，AChE活性降低和ChAT活性增强，说明长期低剂量电磁辐射会引起胆碱能系统紊乱。这与Obajuluwa等［17］的研究结果（2.5 GHz射频辐射使整个大脑的AChE活性降低，而突触内的Ach含量增加）相似。

对大脑认知能力发挥重要作用的还包括一些单胺类神经递质，譬如NE、DA、5-HT等。DA在控制机体行为运动、情绪以及感知方面是必要的，5-HT系统在大脑发育、学习认知以及情绪调节中至关重要，它可以抑制学习记忆能力，其含量的升高可以损害认知灵活性［18］。有研究报道，单胺类神经递质NE与5-HT可以和胆碱能系统产生交互作用［19］，学习记忆的过程非常复杂，是由各类神经递质与神经系统共同合作完成。本研究观察到在辐照结束后0 d神经递质DA和5-HT含量升高，这与赵晓琳等［20］发现的918 MHz、1 mW/cm2的微波辐射（45 d（1 h/d））会引起DA、NE和5-HT水平升高的结果相类似。而流行病学调查中指出的使用移动设备通话1 h以上，会出现眩晕、烦闷、注意力不集中、记忆力下降、疲劳、头疼等不适症状［21］，也暗示了长期电磁辐射会引起体内神经递质水平的紊乱。在本实验条件下这种紊乱现象只是暂时的，可随照后时间的延长自行恢复。而且，这一紊乱也并不足以引起大鼠学习记忆功能的明显下降。

本研究的实验条件更加真实地模拟现实生活中的人们所处的电磁环境，实验结果显示，在安全限制标准下，长期低剂量电磁辐射对生物体也会有一定的影响，但在14 d后会恢复至正常水平，这也为电磁暴露剂量的安全限值标准的完善提供数据支持。