基于circNRG-1/miR-193b-5p/NRG-1探讨肥胖性高血压发生的分子机制

王玉孝，李 俊，汪生毅，白雪莲，李春梅，高登峰

由于现代生活方式的改变，肥胖正以一种惊人的速度在全球肆虐流行，严重危害人类健康。肥胖会导致多种心血管疾病的发生，其中高血压病是最为常见的，60%～70%的高血压可能归因于肥胖。据报道，每增加10%的体质量，收缩压就会增加6.5 mmHg。但是，肥胖引发高血压的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

人神经调节蛋白1(NeuRegin-1,NRG-1)是表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)家族的一员。研究发现，NRG-1在血管病理生理中起着重要作用，其可以在血管内皮细胞和平滑肌细胞中表达，也可明显的抑制体外培养的平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的增殖和迁移。环状RNA (circular RNA,circRNA)是一类形成共价封闭循环的非编码RNA，它是由许多原始RNA转录体反向衔接形成的，在脊椎动物中，大多数RNA在转录后4～5 h内被核糖核酸酶(Ribonuclease R,RNase R)降解，但circRNAs是非常稳定的。circRNAs在癌症、心肌肥大、动脉粥样硬化等具有血管风险疾病的生理病理过程中发挥着重要作用。但是circRNAs对高血压的作用机制尚不清楚，该研究基于circNRG-1/miR-193b-5p/NRG-1轴探讨肥胖性高血压发生的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验所用大鼠均购自兰州大学实验动物中心[许可证号：SCXK(甘)：2017-0001]，90只实验用SD大鼠，雌雄各半，体质量200～250 g，适应性喂养1周后开始实验。本实验设计及过程均经青海省红十字医院动物伦理委员会批准。

1.2 主要药品、仪器与试剂

1.2.1

主要药品与试剂 NRG-1阻断剂CGP52432(ProSpec公司，批号：SMC-112B-DY488)、10%水合氯醛溶液(广州化学试剂厂，批号：AR201704)、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：G1120)、大鼠抗NRG-1、circNRG-1、miR-193b-5p的原代抗体购自美国ABCAM公司。

1.2.2

仪器 BS110S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、alphaEaseFC 型灰度分析软件( 美国Alpha Innotech公司) 、T100 型实时荧光定量聚合酶链式反应仪(Real-time PCR)(北京伯辉生物科技有限公司) 、DYY-1C型凝胶成像系统(北京六一仪器厂) 、TE77XP型半干转膜仪系统(美国Hoefer公司)、CUT4062型石蜡切片机(德国SLEE公司)。

1.3 方法

1.3.1

分组与动物模型制备 采用随机数字表法将90只SD大鼠分为空白对照组(

n

=30)、肥胖性高血压组(

n

=30)、NRG-1阻断剂组(

n

=30)三组，肥胖性高血压组和NRG-1阻断剂组参考文献方法制备肥胖性高血压大鼠模型，大鼠给予高脂饮食并筛选出肥胖性高血压大鼠，筛选标准为：大鼠的体质量比普通饲料喂养的大鼠重20%[(单只高脂饮食组大鼠体质量-空白对照组体质量均值)/空白对照组体质量均值≥20%]，且收缩压≥140 mmHg。高脂饲料的配方为：100 g的基础饲料中加入10 g奶粉、10 g猪油、1个鸡蛋、10滴鱼肝油，需当日配制饮食；NRG-1阻断剂组从造模开始第1天给予10 nmol/L NRG-1阻断剂CGP52432，每天1次，连续治疗12周；空白对照组大鼠给予普通饲料喂养。造模过程中，空白对照组大鼠无死亡，肥胖性高血压组大鼠死亡2只，NRG-1阻断剂组大鼠死亡3只，各组间数量差异无统计学意义。

1.3.2

血压的检测 先将大鼠固定于血压检测器中使其适应里面的环境后，每2周检测一次血压，连续检测12周。连续检测5次的值相差≤5 mmHg时为检测数据有效，最终结果取5次测定结果的平均值。

1.3.3

体质量、Lee系数、脂肪系数的检测 每2周测定一次大鼠的体质量，连续检测12周并记录。12周后，采集5 ml的血样，静置10 min后3 000 r/min分离血清，取上清液，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中三酰甘油和总胆固醇水平，计算Lee系数，计算公式为：Lee系数=体质量(g)1/3×1 000/体长(cm)。然后打开腹腔，取腹股沟、腹膜后、附睾、肠系膜的脂肪垫称重并计算全身脂肪质量，计算大鼠的脂肪系数，计算公式为：脂肪系数=(脂肪质量/大鼠体质量)×100%。

1.3.4

胸主动脉病理学形态观察 待血压、体质量检测完毕后，每组取9只大鼠禁食不禁水12 h，40 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，分离大鼠的胸主动脉，一段用4%多聚甲醛溶液贮存，待其常规脱水后浸蜡，包埋4 μm连续切片采用HE染色并在显微镜下观察，采用MPIAS-500多媒体彩色病理图像分析仪分析大鼠胸主动脉的图像，测量血管壁中膜厚度(media thickness,MT)。另一段胸主动脉贮存于5%戊二醛溶液中，用磷酸缓冲液漂洗后用1%锇酸固定，染色，逐级乙醇脱水，浸渍，包埋，超薄切片机切片，观察胸主动脉的病理组织学变化。

1.3.5

NRG-1蛋白水平的检测 待血压、体质量检测完毕后，每组取9只大鼠禁食不禁水12 h，40 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，分离大鼠的胸主动脉，采用Western blot法检测血管中NRG-1的蛋白水平，具体步骤如下：精密称取大鼠胸主动脉0.1 g后充分剪碎，加入裂解液、离心(3 500 r/min 离心10 min，离心半径8 cm)，用组织蛋白抽提试剂盒提取相应组织蛋白，采用BCA法检测蛋白的浓度，并将其制成含等量蛋白的蛋白组织样品。加入蛋白上样缓冲液并煮沸后，SDS-PAGE凝胶进行电泳，半干转膜仪转膜，加入anti-NRG-1(1 ∶500)一抗孵育，置于4 ℃条件下放置过夜，二抗(1 ∶5 000)孵育后ECL显色，化学发光法检测，Quantity one软件进行图像分析。

1.3.6

RT-PCR检测胸主动脉中NRG-1、circNRG-1、miR-193b-5p的mRNA表达 待血压、体质量检测完毕后，每组取9只大鼠禁食不禁水12 h，40 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，分离大鼠的胸主动脉，按照逆转录试剂盒及PCR试剂盒操作步骤进行反转录及实时荧光定量PCR反应。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.7

微阵列分析 用QIAzol裂解试剂提取大鼠脂肪中的circRNA。根据Arraystar的标准程序进行样品制备和微阵列杂交，总RNA用RNaseR消化后去除线性RNA，丰富circRNA。利用Arraystar SuperRNA标记试剂盒采用随机引物方法将富集的circRNA扩增并转录成荧光cRNA，标记的cRNAs与Arraystar鼠环RNA阵列V2杂交，再用G2505C扫描仪对阵列进行扫描，使用Agilent(11.0.1.1版)特征提取软件对采集到的阵列图像进行分析。

1.3.8

双荧光素酶报告实验验证circNRG-1与miR-193b-5p之间的靶向关系 将miR-193B-5P MIMIC和NC MIMIC与circNRG-1、circNRG-1 MUT、NRG-13′-UTR、NRG-13′-UTR MUT的荧光素酶报告质粒或空载体联合转染293T细胞。24 h后收集细胞，按照双荧光素酶报告基因试剂盒说明书进行荧光素酶活性检测。实验重复3次。

1.3.9

circRNA-miRNA-mRNA调控网络 基于ce RNA理论，利用Cytoscape软件(http://www.Cytoscape.org/)构建circRNA-miRNA-mRNA调控网络，并将其可视化。网络图通过节点和连线以直观的方式表示circRNA-miRNA-mRNA的互作关系，其中每个节点代表不同的RNA分子，连线代表节点之间的相互作用。

2 结果

2.1 circNRG-1在大鼠胸主动脉中表达

结果发现，在散点图中，高于绿线以上的circRNAs和低于绿线的circRNAs在两组间的变化>1.5倍，两组之间有382个circRNAs的差异表达，其中235个表达上调，147个表达下调(>2倍)。结果表明，与空白对照组比较，肥胖性高血压组的MMU-CircRNA-42742(其父本基因为NRG-1)上调，此外肥胖性高血压上调了circNRG-1的表达。结果见图1。

图1 circNRG-1在大鼠胸主动脉中表达A：散点图分析两组环状RNA表达的差异(散点图，横坐标表示 circNRG-1变化以P值的-log10表示，纵坐标表示两组中circNRG-1表达倍数数值以log2表示。横坐标的绝对值越大，两组之间表达量的差异越大；纵坐标值越大，差异越显著)；B：系统聚类分析(红色代表表达上调，蓝色代表表达下调)；C：发散引物；D：聚合酶链反应

2.2 大鼠不同时间点的收缩压、体质量结果

与空白对照组比较，肥胖性高血压组大鼠的收缩压、体质量、Lee系数、脂肪系数、血清中三酰甘油、总胆固醇显著升高，差异有统计学意义(

P

<0.05)；与肥胖性高血压组比较，NRG-1阻断剂组大鼠的收缩压、体质量、Lee系数、血清中三酰甘油有所降低，差异有统计学意义(

P

<0.05)，脂肪系数和总胆固醇虽有所下降，但差异无统计学意义。结果见表2～5。

表2 大鼠不同时间点的收缩压

2.3 大鼠胸主动脉病理学结果

HE染色显示空白对照组大鼠胸主动脉形态大致正常，主动脉内膜、中膜、外膜3层结构排列规整，界限清晰；血管内膜光滑，血管中膜弹性纤维呈同心圆排列，中膜无增厚，平滑肌排列规则，无肥大增生；肥胖性高血压组大鼠胸主动脉出现轻微血管重构情况，主动脉内膜增生不明显，部分内膜脱落；中膜弹性纤维形态不规则，部分出现断裂，平滑肌细胞无增生；NRG-1阻断剂组大鼠胸主动脉血管重构表现。结果见图2。

图2 大鼠胸主动脉病理学结果 HE×400

2.4 NRG-1蛋白表达

与空白对照组比较，肥胖性高血压组大鼠胸主动脉中的NRG-1蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(

P

<0.05)；与肥胖性高血压组比较，NRG-1阻断剂组大鼠胸主动脉中的NRG-1蛋白表达有所降低，差异有统计学意义(

P

<0.05)。结果见图3。

表3 大鼠不同时间点的体质量

表4 大鼠肥胖相关指标结果

表5 大鼠的脂肪分布情况

图3 NRG-1蛋白表达1:空白对照组;2:肥胖性高血压组;3:NRG-1阻断剂组；与空白对照组比较:#P<0.05；与肥胖性高血压组比较:*P<0.05

2.5 NRG-1、circNRG-1、miR-193b-5p的mRNA表达

与空白对照组比较，肥胖性高血压组大鼠胸主动脉中的NRG-1、circNRG-1的mRNA表达升高，miR-193b-5p的mRNA表达降低，差异有统计学意义(

P

<0.05)；与肥胖性高血压组比较，NRG-1阻断剂组大鼠的NRG-1、circNRG-1的mRNA表达降低，miR-193b-5p的mRNA表达升高，差异有统计学意义(

P

<0.05)。结果见图4。

图4 NRG-1、circNRG-1、miR-193b-5p的mRNA表达1:空白对照组;2:肥胖性高血压组;3:NRG-1阻断剂组；与空白对照组比较：#P<0.05；与肥胖性高血压组比较：*P<0.05

2.6 CircRNA-miRNA-mRNA调控网络

circRNA-miRNA-mRNA调控网络基于共表达RNA构建，并通过Cytoscape 可视化。结果显示，以circNRG-1为中心、5个miRNAs 节点、40个mRNAs 节点组成了CircRNA-miRNA-mRNA调控网络。结果见图5。

图5 CircRNA-miRNA-mRNA调控网络

2.7 miR-193b-5p与CircR-NRG-1的靶向关系

采用生物信息学方法在NRG-1 3′-UTR中搜索miR-193b-5p的潜在匹配位点，发现小鼠NRG-1 3′-UTR在544～550和3 195～3 201核苷酸处含有2个miR-193b-5p结合位点(图6A)。为了观察miR-193b-5p对NRG-1表达的影响，研究中构建了野生型pmirGLO-NRG-13′-UTR及其突变体pmirGLO-NRG-13′-UTR，并与miR-193b-5p模拟或miR-CTL共转染293T细胞，结果发现miR-193b-5p模拟物使荧光素酶活性降低50%，而NRG-13′-UTR中miR-193b-5p结合位点的突变在miR-193b-5p模拟物存在下完全恢复了荧光素酶活性(图6B)。

图6 miR-193b-5P与CircR-NRG-1的靶向关系与miR-CTL组比较：#P<0.01

3 讨论

circRNAs是一种新型的非编码的RNA，被认为是一种重要的基因调控因子。到目前为止，已在哺乳动物中鉴定了数千个高表达的circRNAs，并报道了circRNAs的不同功能。circRNAs可以作为miRNA海绵与miRNA反应元件结合来分离miRNAs，从而终止对其目标基因的转录后控制，还可以促进细胞内miRNA的转运，分离RNA结合蛋白，以及通过不完全的碱基配对直接靶向和调节信使RNA。最近有两项临床研究发现circRNAs在高血压中发挥作用；Cheng et al也对高血压研究中广泛使用的4种大鼠品系(S、R、SHR和WKY品系)的circRNAs进行了全基因组范围的调查，并检测到12 846个circRNAs在大鼠肾组织中表达，此外许多circRNAs在正常血压大鼠和高血压大鼠之间差异表达。

NRG-1是一种EGF相关蛋白，它通过红细胞型病毒癌基因同源物在心脏内发挥多种调节作用。NRG-1是由心内膜和心肌微血管内皮细胞合成和释放的，作为对机械牵张、缺氧和信号肽的反应，参与了心室组织中的旁分泌细胞间通讯。有研究发现NRG-1在血管生理病理中起重要作用；NRG-1在血管内皮细胞和平滑肌细胞中表达，其受体定位于潜在的平滑肌细胞；NRG-1处理体外培养的VSMCs，可显著降低血小板衍生生长因子刺激的VSMCs的增殖和迁移。本研究结果发现：在转录后水平上miRNAs或circRNAs是否调控NRG-1的表达，根据circRNAs芯片发现肥胖性高血压模型中circNRG-1被上调。通过散点图确定两组间circRNAs的差异表达水平，发现高于绿线以上的环状RNA和低于绿线的环状RNA在两组间的变化>1.5倍。两组间有382个circRNAs的图差异表达，其中235个表达上调，147个表达下调(>2倍)，肥胖性高血压组的MMU-CircRNA-42742(其父本基因为NRG-1)上调，同时肥胖性高血压还上调了circNRG-1的表达。阻断NRG-1后肥胖性高血压大鼠的收缩压、体质量、Lee系数、脂肪系数、血清中三酰甘油、总胆固醇有所降低，NRG-1表达有所下调，此外，大鼠大鼠胸主动脉血管重构表现。

综上所述，肥胖性高血压大鼠中circNRG-1、NRG-1表达上调，miR-193b-5p表达下调，阻断NRG-1后可以使肥胖性高血压大鼠体质量、血压有所改善，并且可以使circNRG-1、NRG-1表达下调，miR-193b-5p表达上调，说明NRG-1阻断剂在一定程度上改善了肥胖性高血压，而circNRG-1/miR-193b-5p/NRG-1轴可能是治疗肥胖性高血压的潜在靶点。