免疫印迹法和ELISA检测过敏原结果比较

于 潇

（沈阳金域医学检验所有限公司实验室诊断部，辽宁 沈阳 110164）

目前在发达国家和一些地区，过敏人群众多，约七分之一的人可以查出过敏源，发展中国家过敏性疾病发病率逐年上升，过敏为全球性严重的健康问题[1]。近几年，随着生活水平的提高，生活方式的改变，我国变态反应人数增加，目前越来越多患者需要检测过敏原[2]。为了确诊的准确性，本文比较了两种常用过敏原检测方法并探讨免疫印迹法和ELISA检测过敏原结果比较并选取80例标本作为临床观察，希望为临床诊断提供依据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2019年1月在沈阳金域医学检验所有限公司实验室诊断的80例样本，对血清样本进行检测，血清样本为免疫印迹法检测过敏原且另外之后用ELISA再检测过敏原结果，比较两组检查方法检验差异。其中样本患者年龄18～82岁，平均年龄（43±5.20）岁。临床体质量指数（body mass index，BMI）为13.15～29.42 kg/m2，临床基础疾病高血压5例，冠心病12例，糖尿病22例，其中变应性鼻炎32例，荨麻疹30例，支气管哮喘14例，其他变应性疾病4例。经统计学分析样本在年龄、体质量与疾病类型等方面比较临床差异均无统计学意义（P＜0.05）并可以进行比较。

1.2 方法 Western blot试剂由德国Madth公司提供。选择华南地区的组合并包括吸入组、草花粉组合，总免疫球蛋白E和摄入组。将试剂置于室温下25 min，然后用清洗液润湿硝酸纤维素膜并加入260 μL血清，在室温下孵育43 min，用清洁液洗涤7次，加入270 μL抗抗体，然后混合。室温孵育42 min后，漂洗，加入220 μL链霉亲和素标志物并孵育30 min，漂洗加入230 μL底物，孵育30 min漂洗，终止底物酶反应。干燥后测试大约需要4 h。酶联免疫吸附测定试剂采用深圳博卡生物技术有限公司提供，包括吸入组、多种动物毛发多种羽毛、蟑螂、香烟、桑蚕丝、春夏秋花粉、总免疫球蛋白E和饲料组、芝麻、维生素E蔬菜、调味品、总免疫球蛋白E。试剂在室温下放置40 min并将60 μm的血清和IgE加入到每个孔中。120 μL样品稀释剂，38 ℃培养5 h洗涤，加入生物素抗人IgE，38 ℃培养40 min洗涤，加入120 μL辣根过氧化物酶-链霉亲和素耦联物，38 ℃培养40 min洗涤，加入60 μL显色剂A和B培养20 min，添加D60 μL终止液，酶标记选择双波。在430和650 nm处读取吸光度（OD）值。

1.3 统计学方法 使用SPSS20.0对数据进行分析并且P＜0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

两种方法测定家尘和肉制品中的过敏原有一定差异，差异具有临床统计学意义（P＜0.05），但其他过敏原无显著差异，P＞0.05。见表1。

表1 80例样本比较

3 讨 论

Ⅰ型变态反应性疾病，主要是指过敏原第二次接触机体后而发生的反应，可以在数分钟后发生，主要表现为皮肤症状、呼吸道症状、胃肠道症状等，发生次数越多，过敏反应越严重。IgE是血浆在过敏时释放的特性性过敏原，主要由血浆细胞释放，是一种特异性抗体[3]。寻找过敏源，是治疗过敏的主要任务，也是对过敏性疾病诊断的关键，因此，特异性IgE检测，对过敏患者的治疗和预防意义重大[4]。目前，临床上主要使用的诊断方法有两种，即体内试验和体外试验。常用方法是皮刺试验（SPT），但由于SPT结果主观性特别强，并且不安全，一些严重过敏反应的患者，变态反应强烈，风险较大，此外针刺痛苦巨大，多数患者难以忍受[5]。现在除了药物敏感性试验很少使用。血清检测，可用于各种特异性IgE的检测，定量或半定量都可以。血清检测，敏感性高，阳性率也非常高，均高于皮肤试验，并且创伤小，无剧烈的变态反应，患者接受度高[6]。对于那些更愿意接受患者，尤其是儿童的患者来说这几乎是无痛。近年来荧光免疫酶法（FEIA）及化学发光法、免疫印迹法、免疫层析法、酶联免疫吸附试验等方法被广泛应用于过敏原检测。前两种的方法需要特殊设备和试剂[7]。由于前两种的方法需要特殊设备和试剂，基于免疫印迹原理酶联免疫吸附法和半定量检测特异性IgE成本很高[8]。价格相对较低且不仅可以满足临床需求，并且还可以降低患者的经济负担，已经被广泛的应用于临床。本文对临床上比较常用的检测方法进行比较，比较临床常用两种方法[9]。两种方法的共同特点为操作都非常简单，并且酶联免疫吸附法耗时比较少，免疫印迹法的耗时比较长。但是两种检测结果，与其他检测结果区别非常大[10]。这两种方法所用抗原成分复杂性的可能是不同的。肉印迹法以牛肉的为主，酶联免疫吸附测定法以多种肉的为抗原，二者有很大差异，其他过敏原符合率较高[11]。应该指出用于在检测食品过敏原有一个重大的问题，就是大多数被检测出的抗原都是未加工的食品提取物或者一些在食品的加工过程中可以引起过敏的物质，这就导致一些过敏原不容易被筛查出[12]。免疫印迹法源至德国，采用德国MediwisswC公司生产Allery系统，对过敏原进行筛查。系统将过敏原集中在一起，并且并没有修改。采用生物素-亲和素，对硝酸纤维素膜上的微量IgE进行放大[13]，该系统结构稳定，并且较为便宜，不需要昂贵的仪器。在临床上应用比较广泛。目前，临床上较为常规使用的压印检测的系统多数为进口产品，并且价钱比较昂贵，与国内压印检测的系统有相同过敏反应。进口系统原抗决定因素不一致并不符合中国人群过敏原谱，检测患者对不能接触过敏原敏感性，对临床指导意义并不大，而且增加了患者负担，这值得临床考虑。酶联免疫吸附试验（ELISA）也是近年来临床应用一种方法，目前已成为国内主要试剂。方法采用生物素-抗生素-蛋白扩增法来提高特异性IgE检测灵敏度。它既简单又便宜且，研究发现，中国是抗原唯一的来源地。因此这项检测方法更加适合中国人，尤其是在没有特殊设备检验的情况下。酶联免疫吸附试验主要受交叉反应影响，交叉反应可以导致假阳性。这种方法是独一无二的，尤其是在缺乏国际统一标准的特异性的IgE抗体情况下。因此在检测过程中要格外注意不同方法的差异和相关性。在临床上，选择合适的检测过敏原的方法对预防和治疗的过敏性疾病具有重要意义。血清中变应原特异性的IgE水平表达比较单一，只能检测被测试的过敏原敏感性。对于过敏原的筛查，主要依靠血清中的过敏原特异性IgE水平，临床病史也是一个准确地诊断过敏原的方法。笔者研究发现两种方法测定在家尘和肉制品这两样过敏原中有差异，差异具有临床统计学意义（P＜0.05），其他指标无差异。

综上所述，免疫印迹法和酶联免疫吸附法在检测过敏原的时候，各有优缺点，但是目前没有过敏原国际标准，并且缺乏特异性的IgE抗体，并且不同检测方法在结果上不相同，因此应该注意不同方法之间的相关性。