BRAF 基因突变与中国汉族人皮肤恶性黑素瘤的关系研究

叶文正 王珊珊 李词娟 吴一文 刘汉忠 方木平

黑素瘤是一种恶性黑素细胞肿瘤,恶性程度高,容易出现远处转移,预后极差。在黑色素细胞演变为黑色素瘤细胞的过程中,伴随多个癌基因活化以及抑癌基因的失活,BRAF 基因为其中之一。BRAF 基因是一种癌基因,位于染色体7q34,编码一个67000-99000的丝/苏氨酸蛋白激酶。BRAF 基因在黑素细胞特异的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径中起着关键作用,它参与黑素刺激素活化细胞表面黑素皮质激素-1 受体,进而参与黑素细胞的增殖、分化过程。它将细胞表面的受体和RAS 蛋白通过MEK 和细胞外信号调节激酶(ERK)与核内的转录因子相连接,调节细胞的生长、发育。BRAF 突变后激活MEK-ERK 信号通路导致细胞出现恶性增殖。欧美研究中,白种人BRAF 基因突变为40%～60%［1］,中国人群黑色素瘤中,BRAF 基因突变率和欧美国家可能有所差别,本课题组拟通过研究中国汉族人皮肤肢端恶性黑素瘤和非肢端恶性黑素瘤BRAF 基因突变和临床表型及病理特征的关系,为中国汉族人皮肤恶性黑素瘤个体化精准靶点治疗提供理论依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016～2019 年在孝感市中心医院皮肤科连续确诊的79 例中国汉族人恶性黑素瘤患者的石蜡包埋组织,患者中男46 例,女33 例；平均年龄(58.48±13.15)岁。同时选取同期在本院行手术切除的80 例中国汉族人色素痣患者的石蜡包埋组织,患者中男50 例,女30 例；平均年龄(48.01+15.60)岁。整理并收集恶性黑素瘤患者临床资料包括性别、年龄、发病部位、Breslow 厚度、有无溃疡及临床分期等。所有病例均由至少1 位皮肤科和1 位病理科副主任及以上医师进行诊断,疑难病例则由多位皮肤科医师和病理科医师共同讨论后诊断。全部患者均未做化疗、放疗及抗免疫等治疗。该研究通过本院伦理研究委员会批准,批准号(sk2017001)。

1.2 肿瘤基因组DNA 提取和PCR 扩增目的基因 手动分离石蜡包埋组织中的肿瘤细胞,基因组DNA 提取按照上海生工Ezup 柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒说明书进行提取。采用巢式聚合酶链式反应(PCR)扩增BRAF 基因11 和15 外显子。设计巢式PCR 特异性检测引物,见表1。引物委托上海生工生物技术服务有限公司合成。BRAF 基因11 外显子外围引物为BRAF-11-FO 和BRAF-11-RO,扩增的目的条带为393 bp,内嵌引物为BRAF-11-FI 和BRAF-11-RI,扩增目的条带为329 bp；BRAF 基因15 外显子外围引物为BRAF-15-FO 和BRAF-15-RO,扩增的目的条带为458 bp,内嵌引物为BRAF-15-FI 和BRAF-15-RI,扩增目的条带为312 bp。PCR 反应条件为初始变性95℃ 5 min,变性94℃ 30 s,退火58℃ 30 s,延伸72℃ 60 s,38 个循环,72℃修复延伸10 min。5 μl PCR 产物用于凝胶电泳鉴定扩增产量和特异性。

表1 BRAF 基因11 和15 外显子引物

1.3 DNA 测序 20 μl PCR 产物送上海生工生物技术服务有限公司纯化,使用美国ABI 公司生产的3730XL测序仪对PCR 产物进行测序,BRAF 基因11 和15 外显子均选用内侧上游引物测序,应用Chromas 软件分析测序结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 目的基因凝胶电泳鉴定图

2.1.1 BRAF 基因11 外显子凝胶电泳图 7 个泳道从左到右依次为DNA marker(50 bp ladder)、6 个不同样本BRAF 基因外显子11 的PCR 产物,其中BRAF 基因外显子11 的PCR 产物长度为329 bp。见图1。

图1 BRAF 基因11 外显子凝胶电泳图

2.1.2 BRAF 基因15 外显子凝胶电泳图 7 个泳道从左到右依次为DNA marker(50 bp ladder)、6 个不同样本BRAF 基因外显子15 的PCR 产物,其中BRAF 基因外显子15 的PCR 产物长度为312 bp。见图2。

图2 BRAF 基因15 外显子凝胶电泳图

2.2 测序结果 37 例肢端恶性黑色瘤患者中有7 例发生BRAF 基因15 外显子的V600E 突变,突变率为18.92%；42 例非肢端恶性黑素瘤患者中有17 例发生BRAF 基因15 外显子的V600E 突变,突变率为40.48%；80 例色素痣患者中有5 例发生BRAF 基因15 外显子的V600E 突变,突变率为6.25%,检测出的恶性黑素瘤和色素痣BRAF 基因突位于BRAF 基因15 外显子,且均为V600E(T1799A)突变,11 外显子未发现突变。肢端恶性黑色瘤、非肢端恶性黑素瘤患者BRAF 基因突变率高于色素痣患者,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 三种疾病患者BRAF 基因突变率比较(n,%)

2.3 BRAF 基因突变测序图 V600E(T1799A)突变的测序图显示突变所在位点单峰被双峰取代。见图3。

图3 BRAF 基因突变测序图

2.4 BRAF 基因突变和恶性黑素瘤临床特征及病理的关系 不同年龄、部位、溃疡情况、Breslow 厚度以及临床分期恶性黑素瘤患者BRAF 基因突变情况比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；不同性别恶性黑素瘤患者BRAF 基因突变情况比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 79 例恶性黑素瘤患者BRAF 基因突变和临床表型及病理的关系(n)

3 讨论

恶性黑素瘤是来源于黑素细胞和痣细胞的恶性肿瘤,近年来其发病率呈逐渐上升趋势,是临床上发病率增长最快的恶性肿瘤之一,已经成为严重危及我国人民健康的疾病［2］。黑素瘤患者晚期患者治疗方案有限,中位生存期不足1 年［3］。该病的病因及发病机制尚不完全清楚,可能与痣细胞痣恶变、紫外线照射、种族、遗传、外伤刺激、免疫等多种因素有关,学者对黑色素瘤患者肿瘤细胞的基因突变情况研究显示黑色素瘤细胞基因突变主要集中在MAPK 途径,其中BRAF 基因突变在黑色素瘤中的发生率显著高于其他相关通路蛋白编码基因。BRAF 基因属于迅速加速纤维肉瘤(RAF)基因家族成员,位于染色体7q34,长约190 kb,同属RAF 基因家族的还有ARAF 基因和CRAF 基因。BRAF 基因突变在良性色素痣和发育不良痣中可以发现［4］,在正常的情况下,表皮细胞生长因子与其受体进行结合并导致其活化,然后激活下游的大鼠肉瘤(RAS)蛋白,RAS 蛋白在激活下游的RAF 蛋白,RAF 蛋白激活MEK 蛋白,MEK 蛋白再激活ERK 蛋白,然后ERK蛋白进入细胞和内部通过激活下游的各种基因的转录,让细胞进行增殖、分化、分裂,其中从RAF 到ERK这一段信号通路叫做MAPK 通路［5］。其参与在调节细胞生长、分裂和增殖等方面起着及其重要的作用。BRAF 突变明显增加了BRAF 激酶活性,激活一系列激酶后,继而激活RAF/MEK/ERK/MAPK 途径的信号传导通路［6］,引起一系列自细胞表面至胞核的连锁反应,使有丝分裂能力增强,导致细胞异常增殖和分化,从而形成了肿瘤［7］。目前研究发现有多种BRAF 基因突变类型,其中最重要的就是BRAF 基因的第600 个氨基酸残基,从缬氨酸残基(V)变成谷氨酸残基(E),也就是V600E 突变［8］,由于RAF 蛋白是MAPK 通路的激活介质,因此在正常生理条件下RAF 蛋白受到高度调节。在没有细胞外有丝分裂信号的情况下,RAF 主要是细胞质的,是多蛋白复合物的一部分,此突变可以让BRAF 蛋白一直处于活化的、有激酶活性的状态,通过效应蛋白突变导致的MAPK 信号通路失调在肿瘤转化中起着至关重要的作用,从而导致肿瘤的发生和转移。

恶性黑素瘤有种族倾向性,白种人发病率最高,以头面部最为多见,少见于肢端,黑种人则相反,发病率较低,肢端是最主要发病部位,黄种人的发病率则介于白种人和黑种人之间,一般认为黄种人发生于肢端的恶性黑素瘤多见,且多累及足部。作者对37 例肢端恶性黑素瘤和42 例非肢端恶性黑素瘤患者组织DNA 进行测序分析,发现37 例肢端型患者中有7 例存在BRAF 基因15 外显子的V600E 突变,突变率为18.92%,肢端型黑素瘤患者突变率较低,和土耳其一项研究结果17.1%突变率比较接近［9］,42 例非肢端型患者中有17 例发生BRAF 基因15 外显子的V600E 突变,突变率为40.48%,未检测出其他突变点和11 外显子突变,和文献报道的突变发生率接近［10］,80 例色素痣患者中检测到5 例BRAF 基因的突变,表明中国汉族人非肢端恶性黑素瘤BRAF 基因突变率高于肢端恶性黑素瘤患者,但是在正常色素痣患者中也存在少量BRAF基因突变［11］。

BRAF 突变与恶性黑素瘤临床表型的关系,报道不一。本研究显示不同性别恶性黑素瘤患者BRAF 基因突变情况比较差异无统计学意义(P＞0.05)。以50 岁为年龄界限,年轻黑素瘤患者BRAF 基因突变率较年长患者有更高的突变率,可能和患者本身以及相关的环境等多种因素相关,和既往研究结果相符合［12］。在病理特征上,BRAF 基因突变率和Breslow 厚度、溃疡及临床分期均有关。BRAF 基因突变患者,肿瘤浸润深度更深,因此有更厚的Breslow 厚度,由于肿瘤浸润的深度相对较深,因此肿瘤组织更加容易出现缺血坏死而导致溃疡的发生,同样,肿瘤较深的Breslow 厚度以及坏死和溃疡,肿瘤细胞有更多的有丝分裂,其临床分期也相对更差［13,14］。研究显示,BRAF V600E 突变和肿瘤厚度增加、出现溃疡以及患者的生存时间降低有关,在多因素分析中,V600E 突变是一个独立的预后因素［15］。因此,分析恶性黑素瘤患者临床和病理特点与BRAF 突变的恶性行为的相关性,为临床利用BRAF 突变检测来预测肿瘤恶性程度,以及患者预后提供更加可靠的理论依据,有BRAF 突变的患者同时也受益于该突变点［16］,针对肿瘤细胞的分子靶向治疗以及靶向免疫治疗等新型治疗方法的出现,BRAFV600E 突变的靶向药物维罗菲尼(vemurafenib)和曲美替尼(trametinib)等相继研制成功并先后得到美国食品及药品管理局(FDA)的批准,用于晚期无法切除或转移性黑素瘤的治疗,使患者受益较大,这些分子靶向药物的有效应用以肿瘤细胞的BRAF 基因突变为基础,为黑素瘤患者带来一定希望［17］。

综上所述,本研究初步分析了中国汉族人肢端恶性黑色素瘤和非肢端恶性黑素瘤患者中BRAF 基因的突变情况,显示中国人黑色素瘤患者中BRAF 突变仍为高发突变,非肢端皮肤黑色素瘤中BRAF 基因突变高于肢端皮肤黑素瘤患者的突变。在这些突变中,BRAF 基因的V6OOE 突变是最主要类型,这些初步研究为针对BRAF 基因突变的靶向药物在中国黑色素瘤患者中的应用提供了依据。