母胚亮氨酸拉链激酶（MELK）在肺腺癌中的表达及其与预后的相关性研究

张九国 袁智勇

天津医科大学肿瘤医院放射治疗科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心300060

0 引 言

目前，肺癌是世界上发病率和死亡率最高的癌症之一。美国癌症协会的数据显示，2020年男性和女性肺癌患者的死亡人数均位列所有肿瘤的第一位[1]。可见，肺癌恶性度很高。肺腺癌是发病率最高的肺癌类型之一，肺腺癌是肺小细胞癌的主要亚型，约占肺癌病例数的45%[2]。与肺鳞癌不同，肺腺癌起源于支气管上皮，其发病率低于肺鳞癌[3]。近年来，肺腺癌的发病率和死亡率逐年上升，且多数患者确诊患肺腺癌时即为晚期[4]。目前，肺腺癌的靶向治疗主要是围绕表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，GFR）突变和间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合的基因畸变，针对这些基因畸变的个体化治疗已成为标准治疗方法[5]。但是，靶向治疗后会产生耐药性，导致病情急转直下。因此，寻找新的生物标记物和潜在的治疗靶点以提高肺腺癌的早期诊断率和治疗效果迫在眉睫。

母胚亮氨酸拉链激酶 (maternal embryonic leucine zipper kinase，MELK)是一种蛋白质编码基因，属于磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）相关丝氨酸苏氨酸激酶家族，该家族主要参与细胞周期调控、干细胞自我更新、凋亡和剪接调控等过程。它的初次鉴定可追溯到非洲爪蟾卵母细胞和胚胎[6]。MELK定位于染色体9p13.2，并且被证实在多种肿瘤组织中表达异常上调[7]。在部分肿瘤中,叉头框盒白M1(forkhead box M1,FoxM1)，MYC原癌基因及其家族MYCN转录因子是导致MELK在癌症中高表达的因素[7-10]。但MELK在肺腺癌中的具体机制仍不清楚。国内关于MELK在肺腺癌中的研究鲜有报道。值得一提的是，有文献报道了MELK在肺腺癌中高表达，其中通过筛选寻找出了MELK[11]，其结果与本研究相似，但并未通过相关实验验证。本研究利用生物信息学方法分析MELK与肺腺癌的关系，并使用免疫组化法验证其在组织中的表达情况，属于独立自主的研究。

本研究旨在探究MELK在肺腺癌组织中表达情况，以及MELK的表达对肺腺癌患者的临床预后的影响，探求MELK作为肺腺癌潜在生物标记物和可能治疗靶点的可能性，以期为肺腺癌早期诊断、靶向治疗以及预后检测等提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2014年7月至2019年7月，天津医科大学肿瘤医院收治的经手术治疗的肺腺癌患者70例，年龄（52.70±6.87）岁。所有病例均经术后病理证，患者术前均未经化疗或放疗，且具有完整的病例资料。收集患者的一般临床资料，包括年龄、性别、是否吸烟、肿瘤大小、肿瘤分化级别、原发灶-淋巴结-远处转移（tumor-node-metastasis，TNM）分期、淋巴结转移情况。肿瘤分期根据2010年第7版国际抗癌联盟和美国肿瘤联合会联合制定的TNM分期标准。本研究以1964年赫尔辛基宣言和随后的所有修订案中规定的道德标准为基础，所有患者均已签署知情同意书，本研究涉及的所有患者资料及标本采集工作均获得了患者的知情同意。

1.2 主要材料与仪器

组化抗体Anti-MELK抗体、免疫组化生物素二抗（美国ThermoFisher公司），二氨联苯胺（diamiobenzidine，DAB）显色试剂盒（美国Cell Signaling Technology公司）。

RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司），BX51型显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学检测方法

收集的组织标本首先通过福尔马林固定，再经石蜡包埋。石蜡标本在5℃下切片，在然后在65℃下烘烤40 min进行脱蜡。切片在磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）中洗涤3次，每次2 min。将切片放入枸橼酸缓冲液中，将抗原放入微波炉中还原（高火5 min，中火10 min）。然后除去多余的水，将H2O2滴在湿的盒子中15 min，用PBS缓冲液清洗2 min，重复3次。切片用4%的多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）溶液固定25 min，然后用2%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液在PBS中室温封闭20 min。切片用抗MELK抗体稀释（1∶50~1∶500），4℃孵育过夜。切片在结合辣根过氧化物酶（h orseradish peroxidase，HR P）的生物素二抗中孵育，然后用DAB试剂盒进行染色反应。最后用中性树胶封片，倒置显微镜下观察。

每例患者的肿瘤组织及癌旁组织切片选取3个视野进行检测，结果采用双盲法判断，组织切片中MELK的染色水平评定分为阳性细胞比例和染色强度两项参数。阳性细胞比例评分标准：肿瘤细胞阳性百分数为0%时，记0分；1%~33%时，记1分；33%~66%时，记2分；＞66%时，记3分。阳性染色强度评分标准：阴性染色记0分；低度染色记1分；中度染色记2分；中高度染色记3分。以阳性细胞百分比评分和染色强度评分的乘积判断表达情况，计分范围为0~9分。结果＜1，记0分。1~3分为MELK低表达；4~9分为MELK高表达。

1.3.2 生物信息学分析

基于癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库的基因表达谱交互分析（gene expression profilinginteractive analysis，GEPIA）进行生物信息分析。差异基因的阈值为P＜0.05，log2FC＞1或＜-1，其中FC（fold change）为两组间表达量的比值。同时，以中位数作为Kaplan-Meier生存分析的基础，用虚线标记95%置信区间。

利用GEPIA（http://gepia.cancer pku.cn/detail.php?gene=melk/）分析MELK在肺腺癌和正常组织中的表达情况，以及肺腺癌组中MELK高表达、MELK低表达组与总体生存率和无病生存率之间的关系。

1.4 统计学方法

采用Graphpad 8.0软件处理数据，定量数据以均值±标准差（Mean±SD）表示。两组数据比较时，采用t检验分析；分析临床病理特征与MELK表达之间的相关性时，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌中MELK的生物信息学分析结果

通过GEPIA数据库，分析了483例肺腺癌组织和347名例癌旁正常组织，结果如图1所示。结果表明，MELK的mRNA表达在肺腺癌组织中明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 肺腺癌组织和正常组织中母胚亮氨酸拉链激酶（MELK）的mRNA表达

此外，通过GEPIA数据库进一步分析探讨了MELK的表达与肺腺癌患者预后的潜在关联，共分析了476例（总生存率）和240例（无病生存率）资料。结果表明，MELK高表达组的总生存率和无病生存率均明显低于低表达组（均P＜0.05）（图2）。上述结果提示，MELK的表达与患者的预后显著相关。

图2 MELK表达与肺腺癌患者生存率的相关性

2.2 MELK在肺腺癌组织中的表达

通过免疫组织化学染色方法检测了70例经手术切除治疗的肺腺癌患者的肿瘤组织及对应癌旁正常组织中MELK蛋白的表达情况。结果显示，肺腺癌中的MELK的表达明显高于癌旁正常组织。根据染色的强度，将肺腺癌患者分为高表达组和低表达组，发现MELK在癌旁正常肺组织中的表达量显著降低（图3）。以上结果均说明，MELK在肺腺癌的进展中发挥了重要的作用。

图3 肺腺癌组织和癌旁正常组织中母胚亮氨酸拉链激酶（MELK）的免疫组化结果

2.3 MELK蛋白表达与肺腺癌患者的临床病理特征相关性

为了进一步明确MELK在肺腺癌患者中的临床意义，分析比较了MELK与肺腺癌的临床病理特征之间的相关性。比较了MELK低表达组与高表达组肺腺癌患者的临床病理特征差异，包括年龄、性别、是否吸烟、肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴结转移。结果表明，MELK的表达水平与肺腺癌患者的肿瘤大小（P=0.015）、肿瘤分期（P=0.006）显著相关，而与年龄、性别、吸烟情况、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况的相关性无统计学意义（均P＞0.05）。（表1）

表1 母胚亮氨酸拉链激酶（MELK）蛋白表达与肺腺癌患者临床病理特征的相关性分析

3 讨论与结论

肺腺癌是肺癌中非小细胞型肺癌的主要亚型。目前基因表达谱分析已被广泛用于鉴定和预测癌症患者预后和生存的分子标志物。但遗憾的是，对与特定生存相关的关键基因的知识仍然非常有限[12]。寻找新的生物标记物进行早期诊断，并针对特定肿瘤找到潜在的治疗靶点已成为当今一大研究热点。1997年，研究者首次克隆了MELK cDNA，所克隆的激酶中还包含亮氨酸拉链基序，因此该激酶被称为母胚胎亮氨酸拉链激酶（MELK）[13]。自此，针对MELK的研究拉开序幕。

目前，多项研究结果表明MELK在多种肿瘤中高度表达，包括肾癌、肝内胆管癌。Zhang等[14]发现MELK在Ⅳ期晚期透明细胞肾细胞癌组织标本中上调，并且MELK的上调与晚期疾病状态显著相关。Cigliano等[15]证实了MELK在肝癌肿瘤组织中的表达明显高于相应的非肿瘤组织，且MELK的高水平与患者的短生存期有关。Maes等[16]发现MELK在弥漫性大B细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤组织中高表达，且与弥漫性大B细胞淋巴瘤较差的临床结果相关。本研究结果与上述结果一致，本研究结果显示MELK与肿瘤大小、肿瘤分期都具有明显的相关性，而免疫组化染色结果显示MELK蛋白在肺腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。上述结果提示，MELK在多种肿瘤的发生发展中所发挥着重要作用，与肿瘤的进展和预后生存息息相关。

本研究结果初步证实了MELK与肺腺癌之间的关系，具体机制还有待进一步通过实验来探究。研究者对MELK在其他肿瘤中的机制开展了大量研究。Zhao等[17]研究发现长非编码RNA LINC02418在结直肠癌中显著过表达，LINC02418通过吸收miR-1273g-3p充当ceRNA来上调MELK表达，LINC02418-miR-1273g-3p-MELK轴在结直肠癌的发生中起关键作用。对于MELK与肺腺癌的关系，Tang等[18]初步证实了MELK通过介导Slug、Twist1、基质金属蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）、N-catenin和E-catenin的表达介导肺腺癌细胞的转移，通过PLK1-CDC25C-CDK1途径调节G2/M期，参与抑制细胞凋亡。但是，在细胞凋亡方面，MELK与肺腺癌的机制目前仍尚不明晰。

综上所述，本研究结果初步证实了MELK与肺腺癌之间的关系，为进一步探究MELK成为肺腺癌的潜在生物标志物和可能的治疗靶点提供了一些思路。本研究采集的病理样本共70例，样本量不大，可能存在结果偏倚，下一步将构建生物模型并开展相关生物和细胞实验，进一步探究MELK在肺腺癌中的作用，包括相关信号转导通路、基因表达改变等，以期揭示MELK在肺腺癌中的具体机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突