益心通脉颗粒基于PI3K/AKT通路对CHD大鼠心肌损伤及应激水平的研究

李楠，洪林巍，丛敬，高嵋，张桐桐

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)是我国高发疾病。目前，随着全球人口老龄化进程加快，CHD已经成为全球死亡率升高的主要原因[1]。CHD是冠状动脉缺氧、狭窄而引起的血管狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧导致心脏疾病，其发病机制尚未完善，是多因素共同导致的结果。现在关于CHD发病机制学说颇多，已经证实氧化应激与CHD的发生发展密切相关，其通过上调巨噬细胞及中性粒细胞活化而释放大量炎性因子参与血管损伤，影响心室重构，加剧心肌细胞凋亡[2]。病理学研究证实，CHD患者中氧化应激指标,如超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)降 低，丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）显著升高，能够加快冠状动脉斑块聚集，促进斑块形成而损伤心肌细胞[3]。

磷脂酞肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路在调控心肌细胞活性及心肌功能上具有重要作用。相关研究证实，在CHD大鼠中经SO2预处理后PI3K/AKT表达激活，说明提高其表达对心肌具有保护作用[4]。PI3K/AKT通过调控血管平滑肌细胞增殖、迁移而导致粥样斑块产生，促进CHD疾病形成。PI3K/AKT信号通过调节因子，能够介导多种生物学效应，调节心肌细胞活性，在心血管疾病中发挥重要作用。中医将CHD归属于“胸痹”、“心痛”范畴，结合中医基础理论，众多学者均认为益心通脉颗粒能够改善胸痹，缓解气虚及血癖的功能。益心通脉颗粒是由玄参等药物组成，能够改善CHD大鼠血脂代谢，缓解病症，但其对PI3K/AKT信号通路及氧化应激的影响尚不明确[5]，本研究通过建立CHD大鼠模型观察益心通基于PI3K/AKT通路对其心肌损伤及应激水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物3～4月SPF级Wistar健康大鼠60只，均经BL-4205系统检测无心电异常（湖南斯莱克景达实验动物有限公司），动物许可证：SCXK(湘)2018-0012，体质量200～220 g，适应性喂养7 d后进行实验。

1.2 药物、主要试剂与仪器益心通脉颗粒（辽宁中医药大学附属医院药剂科提供）；格列吡嗪片，规格：5 mg（浙江海力生制药有限公司，国药准字：H19983114）；四氧嘧啶（南京森贝咖生物科技有限公司）；垂体后叶素（南京新贝药业有限公司）；4%多聚甲醛（武汉卡诺斯科技有限公司）；苏木精-伊红（HE）染色液（广州威佳科技有限公司）；免疫组化试剂盒（武汉卡诺科技有限公司）。

1.3 分组及CHD动物建模将60只大鼠按照数据随机法分为A组（正常组）、B组（CHD组）、C组（格列吡嗪药物对照组）、D组（低剂量益心通脉颗粒组）、E组（中剂量益心通脉颗粒组）及F组（高剂量益心通脉颗粒组），每组10只，除A组外其余组均给与高糖饲料（在正常饲料中加入蛋黄粉10%、胆固醇2%、猪油10%、丙基硫氧嘧啶0.2%、胆酸钠0.5%），建立CHD模型，在24～27℃饱和湿度下连续喂养8周后，腹腔注射30 U/(kg·d)垂体后叶素，连续3 d。A组大鼠普通饲料喂养8周后,腹腔注射5 ml/d生理盐水，连续3 d。

1.4 干预方法建模成功后，C组大鼠给予0.5 mg/kg格列吡嗪溶于2 mL蒸馏水灌胃；D组、E组及F组大鼠均给予1.25 mg/kg、2.5 mg/kg及5 mg/kg的益心通脉颗粒溶于2 ml蒸馏水灌胃，其余组别大鼠均灌胃2 ml生理盐水溶液，均干预4周。

1.5 各组大鼠血清氧化应激指标比较采用1%戊巴比妥钠80 mg/kg麻醉大鼠，仰卧位固定大鼠，分离腹腔，暴露后腹膜收取4 mL的主动脉血，转移离胶试管中，3 500 r/min离心（离心半径10 cm），上清液放置-4℃保存。采用分光光度计检测MDA、SOD、NO及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）。

1.6 组织提取及HE染色同上方法麻醉大鼠，提取心脏，甲醛固定后进行石蜡包埋，后进行5 μm切片，脱蜡后采用95%的酒精脱水，切片先放入苏木精染色10 min后小流量自来水冲洗，1%的盐酸乙醇褪色变红后停止操作，采用碳酸锂浸泡2 min后1%伊红复染，逐级透水。光学显微镜下观察心肌组织形态。

1.7 TUNEL法检测各组大鼠心机细胞凋亡率心肌组织甲醛中固定4 h，脱水，经辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）催化底物后生成深棕色沉淀物，采用苏木精细胞核染色后，显微镜下观察每张切片随机选取不交叉重复的5个视野的深棕色沉淀物，颜色越深表示凋亡越多。凋亡率：凋亡/总细胞×100%。

1.8 免疫组化检测心肌组织中PI3K、AKT表达心肌组织切片进行二甲苯脱蜡，逐级酒精浸水，枸橼酸盐水修复，自来水冲洗，加入PI3K、AKT抗体，4℃过夜后，放入山羊抗兔二抗孵育30 min，DAB染色，苏木精复燃后逐级脱水，光镜下观察分析MIVnt图形采集检测阳性细胞吸光度，取平均值。

1.9 免疫印迹检测心肌组织中PI3K、AKT蛋白心肌组织采用1%裂解液，BCA检测蛋白，加入样品后，进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，封闭1.5 h，PI3K（1：1 000）、AKT（1：1 000）一抗，内参为GAPDH（1:2 000）,加入HRP标记抗兔IgG二抗（1：2 000），摇匀，采用TBST冲洗膜，最后ECI化学发光显色，试验重复3次取平均值。

1.10 统计学方法应用SPSS23.00软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清氧化应激指标比较各组大鼠血清氧化应激指标MDA、SOD、NO及GSH-Px含量比较存在差异（P＜0.05）。和A组相比，B组大鼠血清中氧化应激指标MDA上调，SOD、NO及GSH-Px下调（P＜0.05），和B组相比，C组、D组、E组及F组大鼠血清氧化应激指标MDA下调，SOD、NO及GSH-Px上调（P＜0.05），与C组相比，D组大鼠血清中MDA含量上调，SOD、NO及GSH-Px含量下调（P＜0.05），与D组相比，F组大鼠血清中MDA含量下调，SOD、NO及GSH-Px含量上调（P＜0.05），F组与C组MDA、SOD、NO及GSH-Px含量比较无明显意义（P＞0.05），表1。

表1 各组大鼠血清氧化应激指标比较

2.2 HE染色观察各组大鼠心肌组织形态及结构

A组大鼠心肌组织染色均匀，结构清晰完整，横纹整齐及规则分布，未见坏死溶解及炎症表达。B组大鼠心肌组织纤维组织排列紊乱且间隙增大，出现溶解坏死及炎症浸润显著。C组、D组、E组及F组部分心肌组织可见肥大组织及溶解坏死，但与B组相比，通过药物干预后上述病理症状有所缓解，且C组及F组改善最显著，图1。

图1 各组大鼠心肌组织形态及结构(×200)

2.3 TUNEL法检测各组大鼠心肌组织细胞凋亡率

各组大鼠心肌细胞凋亡率存在差异（F=15.230，P＜0.001），进一步两两比较，B组大鼠心肌组织细胞凋亡率最高，和A组相比差异显著（P＜0.05），与B组大鼠心肌组织凋亡率相比，C组，D组，E组及F组心肌细胞凋亡率均降低（P＜0.05），与C组相比，D组大鼠心肌细胞凋亡率升高（P＜0.05），与D组相比，F组大鼠心肌细胞凋亡率升高（P＜0.05），F组与C组相比无明显意义（P＞0.05），图2、图3。

图2 各组大鼠心肌组织心肌细胞凋亡图（×200）

图3 各组大鼠心肌组织心肌细胞凋亡率比较

2.4 免疫组化检测各组大鼠心肌组织PI3K、AKT阳性表达B组大鼠PI3K、AKT在心肌组织中细胞阳性数量低于A组（P＜0.05），与B组相比，C组、D组、E组及F组大鼠心肌组织中PI3K、AKT细胞阳性数量均升高（P＜0.05），与C组相比，D组大鼠心肌组织中PI3K、AKT细胞阳性数量均降低（P＜0.05），与D组相比，F组大鼠心肌组织中PI3K、AKT细胞阳性数量均升高（P＜0.05），F组与C组相比大鼠心肌组织中PI3K、AKT细胞阳性数量无明显意义（P＞0.05），表2、图4。

表2 各组大鼠心肌组织PI3K、AKT阳性表达数比较（个）

图4 各组大鼠心肌组织PI3K、AKT阳性表达图（×200）

2.5 免疫印记检测各组大鼠心肌组织PI3K、AKT蛋白水平与A组相比，B组大鼠PI3K、AKT蛋白水平在心肌组织中含量下调（P＜0.05），C组、D组、E组及F组大鼠上述指标均高于B组（P＜0.05），与C组相比，D组大鼠心肌组织PI3K、AKT蛋白降低（P＜0.05），与D组相比F组心肌组织PI3K、AKT蛋白升高（P＜0.05），F组与C组PI3K、AKT蛋白水平相似（P＞0.05），表3、图5。

图5 各组大鼠心肌组织PI3K、AKT蛋白电泳图

表3 各组大鼠心肌组织PI3K、AKT蛋白水平

3 讨论

随着经济发展，人们饮食习惯改变及生活压力等多种原因促进CHD发展，影响患者生活质量及生命健康。中医对CHD治疗历史悠久，认为能够通过增加血管活性药物改善疾病的目的[6]。研究证实，氧化应激能增加血管内皮损伤而促进疾病发展。CHD患者氧化应激伴肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)激活能够提高血管紧张素水平，促进氧化酶表达，增加氧化损伤[7]。体内自由基SOD/MDA表达改善能够诱导血管内皮功能损伤。SOD属于一种细胞自由基清除剂，具有促进超氧阴离子发生歧化反应的作用，同时可抑制MDA等氧化因子的表达，具有细胞修复和稳定的作用。CHD存在大量活性氧及活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成，MDA是脂质过氧化物的终产物，参与机体氧化系统失衡，能够较好反应机体过氧化损伤程度[8]。毛海慧[9]研究表明，CHD存在明显的血管炎症损伤的同时伴随NO及GSH-Px降低，证实氧化应激反应参与了CHD疾病早期形成及发展。

格列吡嗪属于磺脲类降糖药物，能够通过与胰岛β细胞上的KATP通道相互结合而上调钙离子通道，血液中较多的钙离子对心脏发挥保护作用，其机制在于能够增加KATP通道的开放而发挥作用。体外动物实验表示，对缺血性心脏病大鼠采用格列吡嗪进行灌胃能够显著减少大鼠缺血再灌注损伤，说明其对心脏具有保护作用[10]。中医认为CHD的发病机理与气血、血瘀及痰阻相关。汉代张仲景认为胸痹是胸中阳气不足、经络不通所导致。经过历代学者研究认为CHD的治病机制在于生血、通气、破淤及化痰[11]。益心通脉颗粒能够通过改善冠状动脉狭窄而降低术后CHD患者MACE发生。益心通脉颗粒是由黄芪、丹参、葛根、人参、当归等组成，黄芪味甘性温，归肝脾经，具有补气、生血、升阳气等功效，在本方中助生血之功效[11]。张子龙等[12]研究表示，丹参味苦性寒，归心、肝经，能够破血、有化瘀及安神等功效。人参味甘，微苦，归肺、心经，是大补之药，能与黄芪合用治疗气虚之症。现代药理标明，中药人参中包含多种天然抗氧化剂，其中人参皂苷能够通过提高CHD血清中SOD表达水平，增加脂质抗氧化能力进而抑制MDA表达。丹参是改善心血管疾病的天然药物，在CHD氧化应激损伤中减少白细胞过度激活而降低血小板黏附抑制血管内壁斑块产生，具有保护心肌作用。荣鸽璇[13]研究表示，抗氧化应激可能是融斑通脉颗粒防治冠状动脉斑块产生的机制之一，与常规西药相比具有安全性高等特点。本文研究证实，益心通脉颗粒能够通过减少CHD大鼠血清中氧化应激水平而降低心肌损伤。

众多文献证实，CHD氧化应激能够改变心肌组织结构，加剧心肌细胞凋亡。体外培养心肌细胞后加入低浓度的H2O2能够促进凋亡，并随着浓度的升高而出现大量凋亡细胞，表示ROS能够作为心肌细胞信号调节因子，当被激活时能够引发细胞凋亡[14]。本研究指出CHD大鼠血清中氧化应激指标表达升高，心肌组织中含有负氧离子及ROS表达升高，能够促进心肌细胞发生解体，这与以往学者研究相似。益心通脉颗粒中的人参主要活性成分为人参总皂苷，可发挥心肌细胞凋亡增加抗氧化能力、减少心肌组织缺血面积、抗心肌细胞凋亡的作用，其机制可能与平衡bac-1/bax平衡相关。员小利等[15]研究表示，丹参发挥保护心肌组织的作用在于降低钙离子超载，增加SOD表达而抑制炎症反应改善心肌细胞凋亡。黄芪是抗CHD常用药物，主要通过稳定心肌组织细胞膜结构及提高心肌收缩能力而改善心肌损伤。陈家显[16]研究表示，芪参益气滴丸通过抑制慢性心衰大鼠心肌组织缺氧缺血而改善心肌组织病理改变，抑制心肌细胞凋亡。本文HE染色发现，CHD大鼠心肌组织形态及结构发生改变，利用TUNEL检测法观察心肌组织出现大量心肌细胞凋亡，通过采用益心通脉颗粒灌胃后CHD大鼠心肌组织形态发生改变，心肌细胞凋亡率降低，表示益心通脉颗粒能够通过调节某种信号通路而减少心肌损伤。本文研究与上述相似。

以往研究证实，在缺氧心血管疾病中PI3K/AKT具有释放NO水平而舒张血管作用。AKT表达上具有激活增加静息时血管直径及血流的作用，可作为血管张力的调节因子[17]。PI3K可与AKT形成PH结构域可发挥细胞信号调节作用[18]。在CHD中PI3K/AKT表达降低，无法发挥信号调节作用，当PI3K/AKT激活后能够抑制CHD大鼠氧化应激反应，降低核转录因子κB活性，提高SOD表达水平[19]。徐源[20]研究表示，黄芪甲苷能够通过提高PI3K/ATK表达而减少心脏缺血再灌注损伤，起到保护心肌的作用。丹酚酸来源于丹参根部，具有抗氧化机制，可降低炎性因子水平，其作用机制主要是通过上调AKT表达、提高细胞凋亡基因（Bacl-2）活性来实现。王亚利[21]表示和血生络方中包含人参、当归、丹参及红景天等，其药用机理在于通过上调缺血心肌组织中碱性成纤维细胞生长因子及PI3K/ATK表达而促进血管新生。本研究证实，益心通脉颗粒能够通过上调心肌组织中PI3K/AKT表达而保护心肌、抗氧化应激损伤，从而减少心肌细胞凋亡等作用。

本研究基于中医理论论证益心通脉颗粒对CHD的作用机制，但是实验设计存在一定不足，由于时间及经费受限，未加入更多组别，如PI3K/ATK抑制剂等，也未进行中西医结合实验探究对CHD的作用机制，今后应加入更多试验，丰富CHD的基础研究，为临床研究提供基础。综上所述，益心通脉颗粒能够通过减少CHD大鼠氧化应激降低心肌组织病理损伤而心肌细胞凋亡，这与上调PI3K/AKT通路表达相关。