BMSC对内毒素诱导的肺泡上皮细胞氧化应激的影响

汪文婧，程储记，陈旭昕，韩志海

[关键字]肺泡上皮细胞；骨髓间充质干细胞；内毒素；急性呼吸窘迫综合症；氧化应激

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由肺内外多种损伤因素引起的临床危重症，目前尚缺乏特异性有效治疗手段[1]。大量的实验研究表明氧化应激与ALI/ARDS密切相关[2-4]，根据ARDS患者多项临床试验结果发现，肺泡上皮细胞处于氧化应激状态下，不断暴露于气态氧和有毒物质，清除过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）及使用抗氧化剂并不能改善ARDS患者预后[5]，那抑制氧化应激的发生是否是治疗ARDS的一个思路？有研究涉及相关领域，如El-Agamy[6]的研究表明，抑制及减少炎症因子及氧自由基的表达，可遏制ALI/ARDS的发生及发展；Ye等[7]在急性胰腺炎-急性肺损伤（AP-ALI）研究中也发现，减少ROS重要氧化剂的产生对AP-ALI有保护作用；Meng等[8]表示黄芩苷对LPS诱导的ALI的保护作用主要是维持了氧化和抗氧化应激的平衡。结合相关理论知识，本研究大胆的推测抑制肺泡上皮细胞氧化应激状态下ROS的产生可以成为治疗ALI/ARDS的新策略。为了验证这一想法，本研究选取了骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）作为治疗手段。

BMSC[9-10]因其具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，取材方便、易于分离培养、免疫原性低等特点，直接使用由骨髓分离扩增的间质干细胞进行移植时，无免疫排斥的问题，因此成为目前较理想的基因工程种子细胞的来源，具有良好的临床应用前景。近年已有研究者[11]将BMSC引入到肺损伤等肺部疾病的治疗中，BMSC在适当条件下可定向分化为肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cell,AEC）和肺血管内皮细胞（pulmonary vascular endothelial cell,PVEC）等多种非造血组织细胞,多项研究[12-13]提示BMSC在内毒素（lipopolysaccharide,LPS）所致的急性肺损伤修复过程中发挥重要作用，并且我们的前期研究[14]中也已经从细胞周期阻滞角度明确了BMSC对PVEC的保护作用。

由于Ⅱ型肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cellⅡ,AECⅡ）的体外培养难度较大，无法保证充足来源，本研究最终选择利用A549细胞代替AECⅡ，A549细胞[15]来源于肺腺癌患者的肺泡基底上皮细胞，保持了典型的AECⅡ的重要特征，由D.J.Giard[16]于1972年从肺腺癌患者的组织中首次分离培养得到，A549细胞株作为AECⅡ的体外模型，已经广泛应用于ARDS和肺泡上皮细胞相关研究[17-18]。本研究利用Transwell共培养体系，在体外通过LPS干预培养AECⅡ，模拟ALI时的炎症微环境，从氧化失衡角度观察BMSC对AECⅡ的影响，以期为BMSC在ALI/ARDS治疗中的应用提供更多实验室依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂人源性A549细胞来源于美国ATCC公司；人源性BMSC细胞由广州赛业生物科技有限公司提供，且已完成干细胞免疫表型及多能分化潜能鉴定；本实验室对这些细胞分别进行传代及继续培养。DMEM/F12培养基和优质胎牛血清（FBS）购于GIBCO公司，Transwell系统购于美国corning公司，LPS（Ecoil O55：B5）、细胞衰老检测试剂盒KGPAG001L购于美国Sigma公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化 物 酶（glutathione peroxidase,GSH）、丙 二 醛（malondialdehyde,MDA）及脂过氧化物（lipid peroxides,LPO）试剂盒购于南京建成公司；CCK-8试剂盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS）试剂盒购于上海碧云天生物技术公司。

1.2 细胞培养BMSC及A549细胞培养基为完全培养基，由DMEM/F12培养基、FBS及双抗（青霉素、链霉素）配置而成，于4℃保存，现用现配，保存期30 d。细胞培养条件均为：37℃、5%CO2及95%湿度，每隔1 d换液1次，2～3 d传代1次，实验用细胞均处于对数生长期。

1.3 Transwell共培养体系为了满足实验共培养的需要，选取0.4 μm孔径、6 well的聚碳酯膜Transwell共培养体系，将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，将BMSC细胞接种于上室，下室接种A549细胞。

1.4 预实验：A549细胞活性及通透性检测①将A549细胞接种于6孔培养板上，完全培养基于37℃的5%CO2培养箱中培养过夜后，用0、10、20、40、80、100、150和200 μg/mL LPS干预培养12 h后，使用CCK-8试剂盒进行细胞活性测定。根据试剂说明书，每培养孔中加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h后，用酶标仪测量450 nm处的OD值。②将A549细胞接种于6孔培养板上，完全培养基于37℃的5% CO2培养箱中培养过夜后，用100 μg/mL LPS干预培养0、2、4、6、12、24 h后，使用CCK-8试剂盒测定不同时间点的A549细胞活性，使用细胞衰老检测试剂盒KGPAG001L检测A549细胞的衰老程度及通透性。

1.5 BMSC与A549细胞共培养以A549细胞为实验对象，单独培养或利用Transwell共培养体系让1×104的BMSC与2×103的A549细胞共培养，根据预实验结果，培养过夜后使用100 ng/mL LPS或等体积的PBS进行干预培养6 h；具体分组及操作如下：①A549组（A549单独培养，PBS干预）；②A549+LPS组（A549单独培养，LPS干预）；③A549-BMSC+LPS组（A549与BMSC共培养，LPS干预）；④A549-BMSC+PBS组（A549与BMSC共培养，PBS干预）。

1.6 ROS水平检测根据活性氧检测试剂盒说明书进行，收集各组的A549细胞样本，悬浮于稀释好的活性氧检测试剂盒中的DCFH-DA无血清培养液中，调节细胞浓度为106/mL，于37℃细胞培养箱内孵育20 min后洗涤细胞样本，最后用流式细胞仪（Ex=488 nm；Em=530 nm）进行检测，根据ROS的荧光强弱判断A549细胞内ROS的表达高低。

1.7 LPO、MDA、SOD、GSH水平检测参照检测试剂盒说明书进行操作，收集各组A549细胞样本于离心管中，用完全培养基混匀获得细胞悬浮液；按各试剂盒说明书进行对应操作后测得各组OD值，根据OD值计算各组LPO、MDA、SOD、GSH水平。

1.8 统计学处理采用SPSS21.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A549细胞活性及通透性A549细胞在10～40

μg/mL LPS干预12 h后，细胞增殖能力显著增强，且呈剂量依赖性(P＜0.05)；当LPS浓度≥100 μg/mL时，A549细胞存活率显著降低(P＜0.05)；其中，150 μg/mL LPS对A549细胞具有明显的细胞毒性，使细胞活性下降到约44%（表1）。LPS可诱导A549细胞的衰老，降低细胞活性，并以时间依赖性的方式增加细胞的通透性；LPS刺激后第6、12和24 h，A549细胞的衰老程度及通透性均有显著性差异（表2）。因此，本研究选择能显著降低细胞活性、增加细胞通透性的合适剂量（100 μg/mL）及最短LPS暴露时间（6 h）进行后续实验。

表1 不同浓度LPS干预培养时A549的细胞活性

表2 100 μg/mL LPS干预培养不同时长时A549的细胞活性及通透性

2.2 A549细胞内ROS水平结果显示，与A549对照组比较，A549+LPS组细胞内ROS表达水平明显升高（P＜0.001）；与A549+LPS组比较，A549-BMSC+LPS组细胞内ROS表达水平明显降低（P=0.001）；A549-BMSC+PBS组与A549对照组比较，其ROS表达水平是减低的（P=0.033）；图1、表3。

图1 A549细胞内ROS的流式细胞仪检测

表3 A549细胞内ROS水平

2.3 A549细胞内氧化因子LPO、MDA的表达水平

结果显示，与A549组比较，A549+LPS组LPO、MDA表达水平明显升高（P＜0.001）；与A549+LPS组比较，A549-BMSC+LPS组LPO、MDA表达水平明显降低（P=0.006、P＜0.001）；A549-BMSC+PBS组与A549对照组比较，其LPO、MDA表达水平是减低的（P=0.012，表4）。

表4 各组A549细胞中LPO、MDA水平

2.4 A549细胞内的抗氧化因子SOD、GSH活性检测结果显示，与A549对照组比较，A549+LPS组SOD、GSH的活性明显降低（P＜0.001）；与A549+LPS组比较，A549-BMSC+LPS组SOD、GSH的活性明显升高（P=0.001、P=0.028）；与A549对照组相比，A549-BMSC+PBS组SOD、GSH的活性呈升高趋势（P=0.001、P=0.002,表5）。

表5 各组A549细胞中SOD、GSH活性

3 讨论

ARDS在病理学上表现为失控的炎症反应引起弥漫性肺泡上皮的损伤[19]，并且AECⅡ主动参与了ARDS的发生、发展与转归，在ARDS发病机制中发挥着十分重要的作用[20-22]，本实验利用AECⅡ模拟肺的微环境，通过LPS诱导在体外创建了ARDS的细胞模型，首次试图从氧化应激角度探究BMSC对AECⅡ的保护作用，拟为临床工作提供相关思路。

氧化应激是由于体内氧自由基的产生和抗氧化能力的不平衡而引起的[23]，其中ROS是评估氧化应激的一个重要指标，是需氧细胞在代谢过程中产生的活性氧簇，主要包括O2-、H2O2、·OH等，是氧的自由基状态，具有较高的活性[24]。ROS可以攻击生物膜和亚细胞结构中不饱和脂肪酸，使膜脂过氧化，导致生物膜的结构和功能损伤，大量的ROS还会损伤线粒体及DNA，当损伤DNA发生难以修复的断裂时，将影响基因水平的转录和翻译过程，严重者可以导致细胞的死亡[25]。ROS代谢过程中产生的MDA、LPO产物，是氧化应激的指示剂，可反映膜脂过氧化的程度及膜系统受损程度[26-27]。本研究也再次论证了在LPS刺激下，A549细胞内ROS的水平明显升高，ROS代谢产物MDA、LPO含量也显著增高，表明LPS所致的A549细胞损伤使其发生了强烈的氧化应激反应。

此次研究中利用MDA、LPO、SOD、GSH评价ROS的产生及清除状态，MDA、LPO含量是反映体内氧化应激及脂质过氧化水平的客观指标，而SOD、GSH活性则是反映机体清除氧自由基能力的客观指标。SOD、GSH-PX是抗氧化系统的抗氧化酶，是重要的抗氧化剂和自由基清除剂，能起到强有力的保护作用，也是清除ROS过程中的最重要的酶，其高低活性标志着ROS的清除状态及机体的抗氧化水平[28-29]。

本研究实验结果显示，在A549+LPS组中，LPS诱导后A549细胞内ROS的水平、MDA、LPO含量均明显升高，而SOD、GSH-PX的活性表现出明显的降低，提示LPS刺激A549发生了强烈的氧化应激，并明显削弱了A549细胞的抗氧化应激能力。在A549-BMSC+LPS组 中，LPS诱 导 后A549细 胞 内ROS的水平、MDA、LPO含量较A549对照组明显升高，SOD、GSH-PX的活性较A549对照组有所降低，而对比A549+LPS组可以发现A549-BMSC+LPS组中ROS的水平、MDA、LPO含量升高是明显减少的，SOD、GSH-PX的活性的降低也是明显减少的，提示在A549与BMSC共培养后，LPS刺激的A549产生的ROS及其代谢产物MDA、LPO明显减少，说明BMSC有所抑制ROS的产生，并且同时增强了A549细胞的抗氧化应激能力，提高了SOD、GSHPX的活性。为了进一步验证这一结果，将A549-BMSC+PBS组实验结果与A549对照组进行比较分析，发现A549-BMSC+PBS组ROS的水平、MDA及LPO含量较A549对照组表现下降趋势，而SOD、GSH-PX的活性表现出明显上升趋势，差异有统计学意义，提示BMSC对A549细胞就从氧化应激角度来说存在保护作用，能正向调节其抗氧化的能力，减弱氧化应激反应，从而在LPS诱导A549细胞发生氧化应激反应时可以一定程度上控制氧化与抗氧化的失衡。

本研究仅仅通过氧化及抗氧化因子，从氧化应激角度明确了BMSC对AECⅡ细胞的保护作用，存在一定的局限性，因ROS与炎症反应密切相关，是炎症反应的启动因素[30]，大量的研究证实，ROS诱导的氧化应激作为ALI/ARDS发病机制的参与者，可以刺激丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）、核苷结合域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体、NF-κB等多种炎性信号通路，引起细胞损伤[4,31-33]。而炎症细胞也可诱导ROS的过度生成，炎症因子如IL-6、TNF-α的爆发可激活中性粒细胞，引起一氧化氮合酶表达增加，导致生成大量一氧化氮，一氧化二氮和超氧自由基发生反应，产生ROS和过氧亚硝酸盐而发生细胞毒性作用，过度活化核修复酶PARP，导致ATP耗尽和细胞损伤，从而加速ALI/ARDS的发生及发展[34-36]。那BMSC对AECⅡ细胞的保护作用是否与抑制炎症反应相关？并且BMSC抑制ROS生成、减轻氧化应激的分子机制是什么？与MAPK、NLRP3炎性小体、NF-κB等多种炎性信号通路是否存在必然联系？这将是我们下一步的研究重点。

综上所述，本研究目前的研究明确BMSC能显著减轻LPS诱导的AECⅡ细胞的ROS生成，同时能正向调节其抗氧化的能力，可以一定程度上抑制LPS诱导的AECⅡ细胞的氧化应激反应。由此我们认为抑制肺泡上皮细胞氧化应激状态下ROS的产生、增强肺泡上皮细胞抗氧化的能力，或许可以成为治疗ALI/ARDS的新策略之一。