富氢水对小鼠脓毒症胰腺损伤的改善作用

李悦娴，秦树存，张锦△

脓毒症是宿主对感染反应失调造成的一种严重全身炎症反应综合征，最终导致多器官功能衰竭和脓毒性休克［1］，是重症感染死亡的主要原因。胰腺损伤是脓毒症重要的器官功能障碍之一［2］。氢分子具有选择性清除羟基自由基和过氧亚硝酸盐阴离子的作用，是一种新型抗氧化剂，于2007 年被首次应用于医疗领域［3］。本课题组前期研究发现，氢分子可明显改善脓毒症诱导的肝损伤［4］、心功能障碍［5］和肺损伤［6-8］。氢分子对脓毒症肾损伤亦有治疗作用［9］，但对脓毒症胰腺损伤是否有改善作用却鲜见报道。本实验通过脂多糖（LPS）尾静脉注射建立小鼠胰腺损伤模型，观察氢分子对脓毒症胰腺损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 LPS 购自美国Sigma-Aldrich 公司；富氢水（HRS）购自北京活力氢源公司；异氟烷购自深圳瑞沃德公司；无水乙醇、二甲苯、中性塑胶购自国药集团化学试剂有限公司；HE 染液套装购自武汉Servicebio 公司；淀粉酶检测试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、髓过氧化物酶（MPO）和丙二醛（MDA）检测试剂盒购自武汉优尔生公司；包埋机JB-P5购自武汉俊杰电子有限公司；病理切片机RM2016 购自上海徕卡仪器有限公司；正置光学显微镜Eclipase E100、成像系统DS-U3购自日本尼康公司；低温高速离心机3-18K购自德国SIGMA公司；酶标仪ELX 808购自美国Biotek公司。

1.2 动物模型制备及分组 SPF 级C57BL/6J 雄性小鼠18只，体质量18～20 g，购自中国医科大学实验动物部。所有动物管理和手术操作均经中国医科大学附属盛京医院医学伦理委员会批准（伦理编号：2020PS701K）。小鼠饲养于标准化环境中，环境温度为（24±2）℃，光照条件为12 h昼夜节律，可自由食用标准食物和饮水。

按随机数字表法将C57BL/6J雄性小鼠分为对照组、模型组（LPS 组）和HRS 处理组（LPS+HRS 组），每组6 只。LPS 组和LPS+HRS 组小鼠给予尾静脉单次注射LPS 5 mg/kg，建立胰腺损伤模型［8］，对照组小鼠尾静脉给予相同剂量的生理盐水。参考本课题组前期研究［5-6］，LPS+HRS 组小鼠在 LPS 给药后1 h 给予10 mL/kg HRS 腹腔注射，对照组和LPS 组小鼠于相同时间点腹腔注射相同剂量的生理盐水。

LPS 给药后24 h，小鼠异氟烷麻醉后仰卧固定，乙醇消毒，经腹正中线剪开皮肤，暴露腹主动脉取血0.5 mL；而后脱颈处死小鼠，取胰腺组织。血液室温自然凝固10～20 min，3 000 r/min离心20 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存备用。胰腺组织一半完全浸泡于10%福尔马林溶液，另一半于-80 ℃冰箱保存。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 小鼠行为学表现 LPS给药后观察各组小鼠精神状态和活动状况。

1.3.2 胰腺组织HE染色和改良Schmidt组织病理学评分 取经10%福尔马林溶液固定后的胰腺组织，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，经70%、80%、90%和无水乙醇浸泡梯度脱水，纯二甲苯透明后，进行石蜡包埋。包埋后切成5 μm厚切片，经脱蜡、复水后，苏木素染色5～10 min，PBS洗涤，0.1%盐酸乙醇分化液分化10 s，伊红染色30 s～2 min，PBS洗去多余染液。经脱水、透明和中性塑胶封片后，置于显微镜下观察。对Schmidt胰腺组织病理学评分［10］进行改良，从水肿、炎症、出血和坏死4个方面对进行胰腺组织病理学量化评分［11］。将出血（实质出血面积）评分进一步改进为：0 分，无；1 分，≤25%；2分，＞25%～50%；3分，＞50%～75%；4分，＞75%～100%。

1.3.3 酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清淀粉酶、胰腺组织炎性因子、MPO和MDA水平 从-80 ℃冰箱取出小鼠血清和胰腺组织。胰腺组织用PBS冲洗后称质量剪碎，按10%匀浆比例加入预冷的含蛋白酶抑制剂的PBS 匀浆。吸取匀浆液到离心管，4 ℃、5 000 r/min 离心5～10 min，取上清液，严格按照试剂盒说明书操作测定血清淀粉酶，胰腺组织TNF-α、IL-6、MPO和MDA水平。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0.1 软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验，组间多重比较行Dunn’s 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠行为学表现 LPS给药后10 h LPS组小鼠出现1 只死亡。因此，各组小鼠24 h 检测数据样本量均为5只。与对照组相比，LPS组小鼠表现为嗜睡、寒战、行动迟缓，梳毛活动减少，并出现严重腹泻。与LPS 组相比，LPS+HRS 组小鼠嗜睡和寒战程度减轻、梳毛活动增加、腹泻减轻、排泄物减少。

2.2 各组小鼠胰腺组织形态学变化 HE染色结果显示，与对照组相比，LPS 组小鼠胰腺出现组织水肿、炎性细胞浸润、出血及坏死，各项改良Schmidt组织病理学评分及总分升高（P＜0.05）；与LPS 组相比，LPS+HRS 组水肿、炎性细胞浸润、出血及坏死程度和范围明显减轻，各项改良Schmidt组织病理学评分无明显变化（P＞0.05），改良Schmidt 组织病理学评分总分降低（P＜0.05）；LPS+HRS组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），见图1、表1。

Fig.1 HE staining of pancreatic tissues in the three groups of mice(×200)图1 小鼠胰腺组织HE染色（×200）

Tab.1 Histopathological scores of pancreatic injury in the three groups of mice表1 各组小鼠胰腺损伤的组织病理学评分 ［n=5，分，M（P25，P75）］

2.3 各组小鼠血清淀粉酶变化 LPS组小鼠血清淀粉酶水平显著高于对照组，LPS+HRS 组小鼠血清淀粉酶水平明显低于LPS 组，但仍高于对照组（均P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of serum amylase level,IL-6 and TNF-α levels in pancreatic tissue between the three groups of mice表2 各组小鼠血清淀粉酶、胰腺组织IL-6和TNF-α水平比较 （n=5，）

Tab.2 Comparison of serum amylase level,IL-6 and TNF-α levels in pancreatic tissue between the three groups of mice表2 各组小鼠血清淀粉酶、胰腺组织IL-6和TNF-α水平比较 （n=5，）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与LPS组比较，P＜0.05

组别对照组LPS组LPS+HRS组F血清淀粉酶（U/L）551.80±26.10 2 627.00±186.40a 1 555.00±142.70ab 289.800＊＊IL-6（ng/L）9.15±0.59 27.81±0.93a 15.42±1.29ab 471.800＊＊TNF-α（ng/L）51.53±1.74 157.10±5.62a 96.07±4.82ab 728.500＊＊

2.4 各组小鼠胰腺组织炎性因子变化 LPS组小鼠胰腺组织中IL-6和TNF-α水平均高于对照组，LPS+HRS 组小鼠胰腺组织中IL-6 和TNF-α 水平均低于LPS组，但仍高于对照组（均P＜0.05），见表2。

2.5 各组小鼠胰腺组织中MPO 和MDA 水平比较 LPS 组小鼠胰腺组织中MPO 和MDA 水平均高于对照组，LPS+HRS 组小鼠胰腺组织中MPO 和MDA 水平均低于LPS 组，但仍高于对照组（均P＜0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of MPO and MDA levels in pancreatic tissues between the three groups of mice表3 各组小鼠胰腺组织MPO和MDA水平比较（n=5，）

Tab.3 Comparison of MPO and MDA levels in pancreatic tissues between the three groups of mice表3 各组小鼠胰腺组织MPO和MDA水平比较（n=5，）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与LPS组比较，P＜0.05

组别对照组LPS组LPS+HRS组F MPO（U/g）10.62±1.11 24.84±0.62a 16.05±5.18ab 27.180＊＊MDA（μmol/g）22.28±1.64 65.20±1.74a 42.82±1.66ab 815.700＊＊

3 讨论

LPS注射是一种简便可重复的标准化脓毒症制模方式，广泛应用于脓毒症各种器官损害的研究。本研究采用LPS尾静脉注射的方式成功建立了小鼠脓毒症的胰腺损伤模型，脓毒症小鼠出现嗜睡、寒战和腹泻等脓毒症行为学表现。此外，本研究结果显示，脓毒症小鼠的胰腺组织学表现为水肿、炎性细胞浸润、出血及坏死，各项改良Schmidt 组织病理学评分及总分、血清淀粉酶升高，与既往研究报道的脓毒症胰腺损伤的病理改变一致［2，11］，提示在LPS诱导的脓毒症中存在严重的胰腺损伤。

氢分子是自然界中最小的分子，可穿透细胞膜和细胞器膜，作用于细胞核和线粒体等其他药物难以到达的靶点，可选择性清除人体内有害的活性氧（ROS）而不干扰人体内正常的氧化还原反应，且终产物为水，无毒无害，因此被众多学者应用于各种氧化损伤和炎症相关疾病的治疗研究中，包括脓毒症器官损伤［12］、胰腺炎［13］、缺血再灌注损伤［14］、阿尔茨海默症［15］和动脉粥样硬化［16］等。HRS 是采用高压物理溶解的方式制成的富含氢分子的水溶液。本研究结果显示，HRS处理后小鼠的嗜睡、寒战和腹泻等行为学表现有所减轻，胰腺组织水肿、炎性细胞浸润、出血及坏死程度降低、总改良Schmidt 组织病理学评分和血清淀粉酶水平降低，提示HRS可明显改善内毒素诱导的小鼠胰腺损伤。与LPS 组相比，LPS+HRS 组小鼠胰腺组织水肿、炎性细胞浸润、出血及坏死的各项改良Schmidt 组织病理学评分无明显变化，推测可能是样本量较小的原因；但改良Schmidt 组织病理学评分总分降低，改良Schmidt 组织病理学评分总分更能评价胰腺组织的整体损伤程度。

炎症是脓毒症的重要病理之一。LPS通过与脂多糖结合蛋白（LBP）结合形成LPS-LBP 复合物，活化Toll 样受体4/核因子-κB（TLR4/NF-κB）通路［17］，促进炎性因子释放，造成级联放大的炎症反应，形成脓毒症炎症反应机制［18］。TLR4 亦存在于胰腺组织中［17，19］。研究发现，抑制 TLR4/NF-κB 通路介导的IL-6 和TNF-α 表达的升高从而降低炎症反应可以改善LPS诱导的脓毒症胰腺损伤［20］。本研究结果显示，LPS 组小鼠胰腺组织中 IL-6 和 TNF-α 较对照组升高，HRS 显著抑制了LPS 诱导的脓毒症小鼠胰腺组织中IL-6和TNF-α表达的升高，提示HRS逆转了介导脓毒症胰腺损伤中的核心炎症机制。MPO 常被用来评价中性粒细胞浸润。既往实验研究发现，在脓毒症肺损伤［6］和胰腺炎［21］中 MPO 升高。在急性胰腺炎中，胰腺组织中的中性粒细胞可形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），活化信号通路，参与炎症反应［13］。本研究结果显示，在脓毒症胰腺损伤中同样存在MPO升高，HRS处理后MPO的升高被明显抑制，提示HRS可显著改善脓毒症胰腺组织中的中性粒细胞浸润，从而抑制炎症。此外，在胰腺炎中存在内源性ROS 生成增多导致的过氧化水平升高［22］。本研究用MDA 评价脓毒症小鼠胰腺组织的氧化应激水平，结果显示，LPS 组胰腺组织中MDA 水平较对照组升高，HRS 处理显著降低了MDA 水平，提示HRS 可明显改善脓毒症胰腺组织的氧化应激损伤。同时，本研究结果显示，HRS 处理后血清淀粉酶、胰腺组织IL-6、TNF-α、MPO 和MDA 水平仍高于对照组，提示单次10 mL/kg 剂量腹腔注射的HRS 并不能独立用于治疗脓毒症胰腺损伤。

综上所述，HRS 可通过抑制炎症反应和降低氧化应激显著改善内毒素诱导的小鼠脓毒症胰腺损伤。HRS 具有温和抗氧化，可穿透细胞膜和细胞器膜，以及抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗休克，调节多种分子通路和自噬等多种作用机制，且成本低廉等优点，故具有较好的研究和应用前景。本研究尚存在不足之处，如未对HRS 改善LPS 诱导的脓毒症胰腺损伤的上下游信号通路进行探索，未设置脓毒症胰腺损伤多时间点和HRS多剂量观察，这将是本课题组下一步的研究方向。