低频超声联合微泡对比剂通过PI3K/AKT通路对乳腺癌耐药株MCF-7/ADR多药耐药的逆转机制研究

贺修宝，胡小梅，郭雅婧△

乳腺癌的发病率居全球女性恶性肿瘤的首位，且在我国的发病率逐年增高［1］。化学疗法作为乳腺癌的辅助治疗方法，广泛应用于不同病情程度患者的术前或术后治疗，有利于限制肿瘤进展，延长患者生存期，然而其缺乏靶向性，且最终会产生耐药，影响治疗有效性［2-3］。低频超声联合微泡（LFUSMB）是近年出现的一项治疗技术，微泡可在低频超声下破裂产生空化作用，增加破裂处血管及细胞膜的通透性，提高药物传递效率，具有针对性和非侵入性，在肿瘤治疗中具有应用前景［4］。研究显示，LFUSMB可提高甲状腺癌细胞中活性氧（ROS）水平，促进自噬性死亡的发生，并抑制黑色素瘤B16 细胞的生长［5-6］。Chen 等［7］发现，LFUSMB 可克服结直肠癌细胞的耐药性，降低耐药蛋白腺苷三磷酸结合盒家族蛋白G 成员2（ABCG2）表达，提高卟啉/喜树碱/氟尿苷对癌细胞的杀伤作用，但其在乳腺癌中的作用机制仍不清楚。本研究通过探讨LFUSMB 对乳腺癌MCF-7/阿霉素（ADR）细胞耐药性的影响并探究其机制，以期为乳腺癌的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7/ADR 细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。阿霉素（ADR，纯度＞98.0%）购自美国Sigma 公司；磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）活化剂 740 YP 购自MCE公司；MCF细胞专用培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；微泡对比剂Sonovue购自意大利Bracco公司；兔抗人P糖蛋白（P-gp）、p-PI3K、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT抗体，小鼠抗人β-actin、抗多药耐药蛋白（MRP）2、乳腺癌抗性蛋白（BCRP/ABCG2）抗体及羊抗兔、羊抗小鼠或兔IgG 抗体均购自美国Abcam 公司；小鼠抗人MRP1、PI3K 抗体均购自Santa Cruz Biotechnology 公司；CCK-8 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；低频超声治疗系统购自美国Philips 公司；电泳仪、酶标仪购自美国BioRad公司。

1.2 细胞培养 将MCF-7/ADR 细胞解冻后离心，采用含1 mg/L ADR 的MCF 细胞培养基悬浮细胞以维持ADR 耐药性，于培养箱（37 ℃、5%CO2）中复苏培养，1周传代3次，收集第3代对数生长期的MCF-7/ADR细胞计数后进行实验。

1.3 CCK-8法筛选LFUSMB作用时间 将1.2中对数生长期的 MCF-7/ADR 细胞制备为 5×105个/mL 的悬浮液，接种于3.5 cm 培养皿中（2 mL/皿），加入1 mL MCF 细胞培养基（含1 mg/L ADR）和30%微泡对比剂混匀。将培养皿置于脱气无菌水填充的水箱中，用超声探头在距培养皿底部1 cm处进行辐射处理即超声处理。超声设置［8］：频率1 MHz，强度1.0 W/cm2，效率70%。将未经LFUSMB 处理的细胞（未超声处理组）和上述经超声处理10 s、30 s、60 s、90 s 的细胞（LFUSMB 10 s组、LFUSMB 30 s 组、LFUSMB 60 s 组、LFUSMB 90 s 组）制备5×104个/mL的悬浮液，接种于96孔板（100 μL/孔），加入MCF细胞培养基（含1 mg/L ADR）。培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，酶标仪测量各孔在450 nm处的吸光度值（A450），细胞活性=［（A450超声处理组-A450空白组）（/A450未超声处理组-A450空白组）］×100%。

1.4 CCK-8 法测定ADR 对MCF-7/ADR 细胞的半抑制浓度（IC50） 对数生长期的MCF-7/ADR 细胞接种于3.5 cm 培养皿中（1×106个/皿）培养，分为LFUSMB 30 s 组（按照1.3 中方法采用LFUSMB干预30 s）和未超声处理组（不经LFUSMB干预），干预后收集细胞制备5×104个/mL 的悬浮液，接种于96孔板（100 μL/孔），加入含终质量浓度0、1、5、10、20、30、40、50、60、70 mg/L ADR的MCF细胞培养基培养48 h后，按照1.3中方法检测各组细胞活性，绘制药物抑制拟合曲线图并计算ADR 对MCF-7/ADR 细胞的IC50。相对耐药逆转倍数=IC50（LFUSMB 30 s组）/IC5（0未超声处理组）。

1.5 细胞分组及处理 对数生长期的MCF-7/ADR 细胞接种于3.5 cm 培养皿中（1×106个/皿）。对照（C）组：采用MCF细胞培养基正常培养；ADR 组：采用加入ADR（终质量浓度20 mg/L）的MCF 细胞培养基培养；LFUSMB+ADR 组：采用加入ADR（终质量浓度20 mg/L）的MCF 细胞培养基培养并经LFUSMB 处理 30 s；另外，为探究 PI3K/AKT 通路对 MCF-7/ADR 细胞耐药性的作用，设置LFUSMB+ADR+740 YP（PI3K/AKT通路激活剂）组：采用加入ADR（终质量浓度20 mg/L）和740 YP（终质量浓度50 mg/L）的MCF 细胞培养基培养并经LFUSMB处理30 s，按上述分组处理后继续培养48 h，收集细胞进行检测。每组重复6次。

1.6 Annexin V-FIFC/PI 法检测凋亡率 取1.5 各组MCF-7/ADR 细胞经胰酶消化后，按照Annexin V-FIFC/PI 试剂盒操作，调整细胞含量为5×105个/mL，加入500 μL 平衡试剂将细胞重悬，依次加入10 μL的Annexin V-FIFC和PI混匀后避光孵育10 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 Western blot 检测蛋白表达 取1.5各组MCF-7/ADR 细胞经胰酶消化、裂解液裂解后，离心保留上清，BCA试剂盒测蛋白浓度。分别取30 μg 蛋白质进行SDS-PAGE 电泳分离，电泳结束后转印至PVDF膜。经奶粉封闭后，加入一抗，包括β-actin小鼠单抗（1∶2 000）、P-gp兔单抗（1∶1 000）、MRP1小鼠单抗（1∶2 000）、MRP2 小鼠单抗（1∶2 000）、BCRP/ABCG2小鼠单抗（1∶1 000）、PI3K 小鼠单抗（1∶1 000）、AKT 兔多抗（1∶2 000）、p-PI3K 兔单抗（1∶1 000）以及 p-AKT 兔多抗（1∶2 000）4 ℃孵育过夜，洗膜后加入羊抗小鼠或兔二抗（1∶3 000）孵育1 h，洗膜后加入ECL 发光液显影拍照，用目的蛋白和β-actin内参条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法 采用GrapdhPad 8.0或SPSS 24.0进行数据处理。数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行Bonferroni-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LFUSMB 对MCF-7/ADR 细胞活力的影响 未超声处理组、LFUSMB 10 s 组、LFUSMB 30 s 组、LFUSMB 60 s 组、LFUSMB 90 s 组 MCF-7/ADR 细胞活 性 分 别 为（100.00±0.05）% 、（97.20±3.67）% 、（93.56±4.95）%、（83.04±3.64）%、（57.58±3.81）%（n=6，F=136.296，P＜0.01）。与未超声处理组比较，LFUSMB 60 s组、LFUSMB 90 s组细胞活性显著降低（P＜0.05），LFUSMB 10 s 组、LFUSMB 30 s 组细胞活性无显著变化（P＞0.05）。后续采用LFUSMB 干预30 s进行研究。

2.2 LFUSMB 对细胞耐药性的影响 LFUSMB 30 s组ADR 对MCF/ADR 细胞的IC5（05.74 mg/L）低于未超声处理组（47.06 mg/L），相对耐药逆转倍数约为8.20倍，见图1。

Fig.1 The effect of LFUSMB on the drug resistance of MCF-7/ADR cells图1 LFUSMB对MCF-7/ADR细胞耐药性的影响

2.3 LFUSMB对细胞凋亡率的影响 C组、ADR组、LFUSMB+ADR 组MCF-7/ADR 细胞凋亡率分别为（1.78±0.54）%、（13.15±1.65）%、（67.59±3.71）%（n=6，F=1 327.427，P＜0.01），见图2。ADR 组细胞凋亡率较C组增高，LFUSMB+ADR 组细胞凋亡率较ADR组进一步增高（P＜0.05）。

Fig.2 The effect of LFUSMB on the apoptosis rate of MCF-7/ADR cells图2 LFUSMB对MCF-7/ADR细胞凋亡率的影响

2.4 LFUSMB 对 MCF-7/ADR 细胞中 MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表达的影响 ADR 组细胞MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表达水平较C 组无明显变化 ，LFUSMB+ADR 组 细 胞 MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表达水平较 C 组和ADR组显著下调（P＜0.05），见图3、表1。

Fig.3 MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions detected by Western blot assay图3 Western blot检测MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表达

Tab.1 Comparison of MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions between the three groups of MCF-7/ADR cells表1 3组MCF-7/ADR细胞MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表达比较 （n=6，）

Tab.1 Comparison of MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions between the three groups of MCF-7/ADR cells表1 3组MCF-7/ADR细胞MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表达比较 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a与C组比较，b与ADR组比较，P＜0.05

组别C组ADR组LFUSMB+ADR组F MRP1 1.86±0.05 1.83±0.07 0.79±0.04ab 742.467＊＊MRP2 1.01±0.09 0.97±0.06 0.42±0.03ab 155.286＊＊P-gp 1.26±0.07 1.23±0.08 0.74±0.06ab 102.966＊＊BCRP/ABCG2 1.95±0.10 1.97±0.09 0.82±0.05ab 378.612＊＊

2.5 LFUSMB对MCF-7/ADR细胞PI3K/AKT通路蛋白表达的影响 ADR 组细胞p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT较C组无明显变化，LFUSMB+ADR组细胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT较C组和ADR组显著降低（P＜0.05），见图4、表2。

Fig.4 The protein expression of PI3K/AKT pathway detected by Western blot assay图4 Western blot检测PI3K/AKT通路蛋白表达

Tab.2 Comparison of PI3K/AKT pathway protein expression between the three groups of MCF-7/ADR cells表2 3组MCF-7/ADR细胞PI3K/AKT通路蛋白表达比较（n=6，）

Tab.2 Comparison of PI3K/AKT pathway protein expression between the three groups of MCF-7/ADR cells表2 3组MCF-7/ADR细胞PI3K/AKT通路蛋白表达比较（n=6，）

＊＊P＜0.01；a与C组比较，b与ADR组比较，P＜0.05

组别C组ADR组LFUSMB+ADR组F p-PI3K/PI3K 0.46±0.09 0.44±0.06 0.21±0.03ab 27.571＊＊p-AKT/AKT 0.57±0.08 0.58±0.05 0.13±0.02ab 127.807＊＊

2.6 PI3K/AKT 通路激活剂对LFUSMB 干预后MCF-7/ADR 细胞凋亡及MRP1、MRP2、P-gp、BCRP蛋白表达的影响 与LFUSMB+ADR 组比较，LFUSMB+ADR+740 YP 组 MCF-7/ADR 细 胞凋 亡 率显著降低，MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白水平显著增高（P＜0.05），见图5、表3。

Fig.5 The MRP1,MRP2,P-gp and BCRP/ABCG2 protein expressions detected by Western blot assay图5 Western blot检测MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表达

Tab.3 Comparison of MCF-7/ADR cell apoptosis rate and MRP1,MRP2,P-gp,BCRP/ABCG2 protein expressions beteween the 3 groups表3 3组MCF-7/ADR细胞凋亡率及MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表达比较 （）

Tab.3 Comparison of MCF-7/ADR cell apoptosis rate and MRP1,MRP2,P-gp,BCRP/ABCG2 protein expressions beteween the 3 groups表3 3组MCF-7/ADR细胞凋亡率及MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2蛋白表达比较 （）

＊＊P＜0.01；a与C组比较，b与LFUSMB+ADR组比较，P＜0.05

组别C组LFUSMB+ADR组LFUSMB+ADR+740 YP组F n6 6 6凋亡率（%）2.40±0.05 81.20±9.64a 19.80±2.05ab 317.564＊＊MRP1 1.23±0.11 0.19±0.02a 1.01±0.08ab 286.095＊＊MRP2 1.29±0.08 0.34±0.03a 1.05±0.07ab 360.049＊＊P-gp 1.34±0.10 0.28±0.04a 1.13±0.09ab 287.848＊＊BCRP/ABCG2 1.57±0.09 0.39±0.03a 1.38±0.08ab 469.208＊＊

3 讨论

目前对乳腺癌等肿瘤广泛采用化学疗法，随着治疗的进行，最终肿瘤细胞会对化疗药物产生继发性耐药，从而限制其疗效［9］。因此寻找改善肿瘤耐药性的新治疗策略至关重要。低频超声通常小于5 W/cm2，是一种物理刺激，作为对比剂的微泡可以增加病灶检测的图像对比度，两者联合用于治疗时可通过声孔效应增强细胞膜和血管系统的渗透，靶向特异性位点传递药物，增强药物或基因传递，改善细胞对药物的摄取，进而提高治疗功效［10-11］。但是，除提高细胞膜通透性外，是否涉及其他机制并不清楚。Qu 等［8］研究显示，强度 1.0 W/cm2，频率 1 MHz的超声联合30%微气泡为MCF-7/ADR 细胞的最佳作用参数，本研究采用上述参数作用MCF-7/ADR细胞60 s 时，观察到细胞活性为（83.04±3.64）%，与上述研究观察到的活性（82.91±2.83）%相近，作用30 s时细胞活性为（93.56±4.95）%，对MCF-7/ADR 细胞的毒性较小，后续按照上述参数采用LFUSMB 干预30 s 进行研究。洪丽杰等［12］发现，LFUSMB 可抑制卵巢癌细胞在裸鼠中的生长。武雨琦等［13］研究显示，LFUSMB 可逆转前列腺癌对紫杉醇的耐药性。本研究结果显示，LFUSMB 30 s组ADR 对MCF/ADR细胞的IC50低于未超声处理组，相对耐药逆转倍数约为8.20倍，进一步分析发现，LFUSMB可促进ADR作用下MCF-7/ADR细胞的凋亡，表明LFUSMB可逆转乳腺癌MCF/ADR 细胞对ADR 的耐药性，其机制有待探索。

PI3K/Akt 信号的活化有利于抑制肿瘤细胞凋亡，维持肿瘤细胞增殖，在人类乳腺癌等肿瘤的发生及多药耐药中具有重要作用［14］。研究显示，通过抑制PI3K/AKT信号通路，核糖体S6蛋白激酶4可以抑制MCF-7/多柔比星（DOX）细胞侵袭和肿瘤生长，促进细胞凋亡，减弱MCF-7/DOX 细胞的DOX 耐药性［15］。Qiu 等［16］发现，低频超声可通过抑制 PI3K/AKT/NF-κB信号通路，下调ABC家族蛋白的表达水平，抑制细胞活力和增殖，逆转胰腺癌的耐药性。本研究发现，MCF-7/ADR细胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT 在 ADR 联合 LFUSMB 作用下显著降低，表明LFUSMB 可抑制PI3K/AKT 信号的活化。MRP1、MRP2、P-gp及BCRP/ABCG2均属于ABC家族蛋白，作为能量依赖性外排泵，可促进细胞对有毒物质的外排作用，从而降低其在细胞内的蓄积，在避免外来毒性物质损伤机体的同时，可能导致细胞对化疗药物产生耐药性［17-18］。研究显示，PI3K/AKT 通路与乳腺癌耐药性有关［19］。另外，抑制PI3K 活化可下调P-gp、BCRP/ABCG2 等 ABC 家族蛋白表达，提高耐药肿瘤细胞的药物敏感性［20］。本研究观察到，LFUSMB 作用后可显著抑制MCF-7/ADR 细胞中MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白 表 达 ，与LFUSMB 对PI3K/AKT 通路的作用趋势一致，由此推测，LFUSMB 作用于 MCF-7/ADR 细胞，可抑制 PI3K/AKT 通路，下调 MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2多种耐药蛋白表达，从而减少MCF-7/ADR 细胞对ADR 的外排，增加ADR 在细胞内积累，诱导细胞凋亡，逆转乳腺癌MCF/ADR 细胞的耐药性。另外，本研究还发现，PI3K/AKT 通路激活剂可拮抗LFUSMB对 MCF-7/ADR 细胞凋亡及 MRP1、MRP2、P-gp、BCRP/ABCG2 蛋白表达的影响，进一步表明LFUSMB 可调控PI3K/AKT 通路活化，逆转乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药性。

综上所述，LFUSMB 可逆转乳腺癌MCF/ADR 细胞对ADR 的耐药性，与抑制PI3K/AKT 通路、下调MRP1 等ABC 家族蛋白表达、增加ADR 在细胞内积累及诱导细胞凋亡有关。但是，PI3K/AKT通路下游仍有多种蛋白级联传递，且多药耐药蛋白表达可受到多种通路调控。本研究仅揭示了PI3K/AKT 通路在LFUSMB 逆转肿瘤耐药性中的作用，后续将对其他通路及PI3K/AKT通路下游靶点进行分析，进一步揭示LFUSMB 逆转肿瘤耐药性的机制，为LFUSMB应用于肿瘤治疗提供参考。