补肾活血法改善精子DNA完整性损伤临床研究

李俊君，董 良，谭 琨，余 颜，俞旭君，阳 方

(成都中医药大学附属生殖妇幼医院，四川 成都 610041)

男性不育症为男科常见的疾病之一，近年来发病率不断上升，已成为一个全球化的社会性问题[1]。男性不育症可能是多种因素造成的结果，在影响人类精子发生的因素中，精液常规检查异常引发的不育已被大众熟知，但仍有检查正常的男性也存在不育。经研究发现，精子DNA损伤作为一种新的精子功能评价指标越来越受到关注[2]。

精子DNA损伤可影响精子的受精能力、受精卵的分裂以及胚胎发育，是影响生育的重要因素。DNA碎片率(DNA fragmentation index，DFI)是目前较常用于评估精子DNA完整性损伤程度的指标，当精子DNA损伤比例大于30%以上时，男性的自然生育力显著降低[3]。氧化应激是精子DNA损伤发生的一个机制。氧化应激指机体遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如ROS和活性氮自由基(RNS)产生过多，氧化程度超出抗氧化物的清除范围，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。过氧化物歧化酶(SOD)是能特异性地清除ROS的一种酶，因此，SOD测定能体现精子在男性生殖道运行中氧化抗氧化的水平和能力。

中医学关于男性不育症的论述主要集中在“无嗣”“无子”等方面。对于久病之人，肾气严重亏损，无处藏精，故久病必虚，虚则血瘀，当用补肾活血之法。成都中医药大学附属医院研发的 “强精片”具有补肾强精、活血化瘀、清热利湿的功效，临床应用已达15年余。研究发现[4]，该药可显著改善男性不育症患者精子动态及形态，有增加精子密度、增加精子活率及活力、改善精子形态等作用。

本文将从“强精片”入手，研究补肾活血法抗氧化作用对肾虚血瘀型男性不育症患者精子DNA损伤的影响并探索其作用机制。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准 参照《人类精子学》(2013版)、《欧洲泌尿外科学会疾病诊断治疗指南》(2014版)、《人类精液检查与处理实验室手册》(WHO第五版，2009年)以及相关试剂盒说明书等制定。(1)夫妇同居一年以上，性生活正常，未采取避孕措施，女方生殖机能正常，因男方因素造成女方不孕者。(2)实验室检查：①精子DNA碎片率(DFI)异常(正常精子DNA损伤率为0%～15%；轻度损伤：精子DNA损伤率为15%～30%；重度损伤：精子DNA损伤率为>30%)。 ②精子活性氧自由基(ROS)异常(正常测试范围：0 RLU/s-5.5RLU/s×104)。③超氧化物歧化酶(SOD)异常(正常测试范围：0.5～15 0ng/mL)。

1.1.2 中医辨证诊断标准 参照《中药新药临床研究指导原则》(2002版)、《中国中西医结合男科学》(张敏健、郭军主编，2011版)制定。主证：久婚未育，肾虚血瘀：腰膝酸软，神疲乏力，小腹隐痛(痛有定处)；次证：性欲低下，头晕耳鸣，小便清长，皮下包块(瘀斑)，舌质紫暗有瘀斑，脉涩或沉细。凡具备主证1项或2项、次证2项，结合舌脉改变，经两名及以上副高专业技术职称人员参与诊断，方可成立。

1.2 纳入标准

①符合西医诊断标准，并且符合中医辨证诊断标准；②不育年限达1年以上，年龄20～55岁的男性不育症患者；③DFI>15%；④无严重器质性疾病和精神、神经系统疾病；⑤患者自愿受试并签署知情同意书。

1.3 排除标准

①因女方因素导致的不能生育者；②泌尿生殖感染、激素异常、染色体核型异常及免疫性引起的男性不育；③合并有心血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病及精神病患者；④不能按规定服药，无法判断疗效或资料不全等影响疗效和安全性判断者；⑤取精困难不能满足实验室检查者。

1.4 一般资料

研究对象为2015年1月-2015年12月就诊于成都中医药大学附属医院的72例男性不育症患者，中医辨证为肾虚血瘀型，以1∶1随机分为两组。研究对象中年龄最小者22岁，最大者43岁，平均年龄(31.71±4.55)岁。

1.5 治疗方法

对照组：五子衍宗丸治疗(提供单位：成都中医药大学附属医院，每盒10袋，每袋6g)，每次1袋，饭后温水吞服，1日2次。连续治疗3个月。

治疗组：强精片治疗，组方：人参、当归、枸杞子、菟丝子、淫羊藿、鹿角胶、车前子、益母草、桃仁、丹参(提供单位：成都中医药大学附属医院中药制剂中心，规格100片/瓶，每片0.3 g，每片含生药0.35 g)，每次4片，饭后温水吞服，每日3次，连续治疗3个月。

1.6 观察指标

通过检测受试者服药前后精子DNA碎片率(DFI)、精子活性氧自由基(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)的变化来评价疗效。DFI检测采用深圳市博瑞德生物科技有限公司生产的精子DNA碎片检测试剂盒(商品名：SpermFuncRDNAf，产品标准号：YZB/粤0439-2010)进行检测。主要方法是利用精子染色质扩散法。ROS检测使用南京建成生物工程研究所研发的试剂盒(产品序号：E004，规格：100T-500T，产品许可证：苏ICP备12006455号)，用化学发光法检测精液ROS水平。SOD变化采用ELISA生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(商品名：Human SOD ELISA kit，货号：XL-Eh1377，规格：96孔/盒，Abcam公司生产，北京永辉生物科技有限公司进口)进行检测。

1.8 统计学方法

2 结果

本研究纳入72例患者，每组各36例，试验过程中治疗组患者因工作原因脱落2例，对照组脱落3例，1例因疗效不满意终止，2例因准备试管婴儿治疗而终止。

2.1 治疗组与对照组平均年龄及不育年限分析结果

通过对两组男性年龄进行分析，t=1.16，P=0.288 3，P>0.05，因此两组年龄无统计学意义，两组具有可比性。对两组男性不育年限的数据分析，平均不育年限为(4.50±1.58)年，经分析得出两组不育年限均呈非正态性分布，故采用Z检验，Z=1.27，P=0.2679，P>0.05，提示两组平均不育年限无统计学意义，两组具有可比性。

表1 两组患者平均年龄、不育年限比较

2.2 治疗前受试者年龄与DFI、ROS、SOD相关性分析

对72例受试者年龄与DFI、ROS、SOD进行相关性线性分析，图1所示年龄与DFI，其线性拟合比率F=4.50，P<0.000 1，具有统计学意义，表明受试者年龄与DFI呈正相关；图2所示DFI与ROS，其线性拟合比率F=0.47，P<0.000 1，具有统计学意义，表明受试者ROS与DFI有相关性，二者呈正相关；图3所示ROS与SOD，其线性拟合比率F=-7.86，P<0.000 1，具有统计学意义，表明ROS与SOD有相关性，二者呈负相关。

图1 年龄与DFI相关性分析

图2 DFI与ROS相关性分析

图3 ROS与SOD相关性分析

2.3 试验后治疗组与对照组DFI、ROS、SOD比较分析

治疗组治疗前DFI平均值为(25.24±9.76)，经过3个月治疗后，治疗组DFI平均值为(10.95±4.55)，Z=9.272 8，P=0.004 5，P<0.05，差异具有统计学意义。对照组治疗前DFI平均值为(23.37±9.91)，经过治疗后，对照组DFI平均值为(15.38±6.33)，Z=8.36，P<0.000 1，差异具有统计学意义。由表2可知，试验组与对照组比较DFI显著下降。

表2 试验组、对照组治疗前后DFI值比较

表3 两组患者治疗前后ROS(RLU/s)比较

治疗组治疗前ROS平均值=(41.41±19.28)%，经过3个月的治疗后，治疗组ROS平均值为(13.74±8.88)%，Z=4.20，P=0.000 2，P<0.05，差异具有统计学意义。对照组治疗前ROS平均值=(42.91±19.74)%，经过治疗后，对照组DFI平均值为(20.37±12.65)%，Z=3.21，P=0.018 1，P<0.05，具有统计学意义。治疗组、对照组ROS平均值较治疗前有显著下降，且治疗组下降明显。

表4 治疗组、对照组治疗前后SOD比较

治疗组治疗前SOD平均值为(14.19±7.15) ng/mL，经过3个月的治疗后，治疗组SOD平均值为(28.01±11.18) ng/mL，Z=7.19，P=0.011 2，P<0.05，差异具有统计学意义。对照组治疗前SOD平均值为(15.99±6.40) ng/mL，治疗后，对照组SOD平均值为(20.20±6.25) ng/mL，Z=6.98，P<0.000 1，差异具有统计学意义。表明治疗组SOD平均值较治疗前有显著提高，且优于对照组。

2.4 中医证候评分疗效比较

两组患者经过3个月治疗后，治疗组总有效率为77.78%；对照组总有效率为66.67%，P<0.05，差异具有统计学意义。表明治疗组运用补肾活血法(强精片)能有效改善中医临床症状，且优于对照组。

表5 两组患者中医证候评分疗效比较 (n)

3 讨论

中医学认为，精子的生成依赖于肾气的温煦与滋养。肾为先天之本，是发育生殖之源。《黄帝内经》提出了以“肾”为轴心的生殖理论。《素问·上古天真论》云：“丈夫……二八，肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子”。肾气的盛衰，天癸的有无，脏腑功能是否协调，直接决定着男性的生殖能力的强弱。故精子质量异常所致男性不育症与中医学的肾虚关系密切。瘀血作为病理产物，可因湿、热、郁煎熬日久，或壅滞血脉，滞血成瘀，或肝失疏泄，气滞阻络而成。《临证指南医案》云“凡经主气，络主血，久病血瘀”，“初为气结在经，久则血伤入络”。皆因病久气血阴阳亏虚，无力鼓动血运，血滞于经；或久病而致气机逆乱，气滞则瘀血易生。男性产精的主要器官睾丸属“阴器”，属体表络脉系统，容易因久病而气血瘀滞。《素问·调经论》云“血气不和，百病乃生”，瘀血内停，脉络瘀滞，气血不运，睾丸失养受损，肾虚精亏，发为不育。在临床中，肾虚与血瘀往往并见，但亦有肾虚为因、血瘀为果者。肾虚可分为精亏、肾气虚、肾阳虚、肾阴虚，然而无论何种肾虚，都有致瘀的可能。《内经》有“肝肾同源”之说，精之不足，无以化血，瘀血而成。故肾虚与血瘀的关系尤为密切，不能分而立论。

现代医学认为，中医理论的肾大致可以理解为现代医学的下丘脑-垂体-性腺、肾上腺组成的内分泌调节轴。精子的发生、成熟、运行以及维持正常和稳定，是通过此轴系的相互匹配、调节整合作用来实现的[5]。更有学者对中医的肾之本质进行研究，认为下丘脑-垂体-性腺轴功能失调是男性不育症的常见病因[6-7]。血在男性生殖生理中起重要作用。首先血有濡养、滋润生殖器官的作用；其次血能运输天癸以达全身，肾气足则天癸至，发挥正常的生理效应：第三，血在体内运行不息，流至精室时，在天癸作用下，可变化为精液。故唐容川在《血证论》中云：“血人丹田，亦从水化，而变为水，以其体内为血所化，故非清水，而极浓极稠，谓之肾精。”现代医学也认为正常的血液运行是生殖系统有生育能力的基本条件。

本研究使用的“强精片”由人参、当归、枸杞子、菟丝子、淫羊藿、鹿角胶、车前子、益母草、桃仁、丹参等药物组成。方中枸杞、菟丝子补肾益精，共为君药。鹿角胶、淫羊藿温补肝肾，益精养血，二者鼓舞肾中阳气，使阴得阳助，而泉源不竭；人参补气生津，丹参、桃仁、当归养血活血，气旺血行，六者合而为臣，使气血顺，阴阳调。车前子清热解毒、利尿；益母草活血化瘀，利水调经，二者共用，一泄肾中虚火，二可制约温热药物之患，三则利水消肿，使水湿得行，邪有出路。桃仁、丹参行血破瘀，使气血通畅。四者相合为佐药。纵观全方，具有“阴阳气血并调、肝肾兼顾；补中有通、补中有清”的特点。故有补肾填精、活血化瘀、清利湿热的功效，可提高男性生殖能力。

研究发现，强精片能提高精子密度、活力及活率、改善精子形态[8-9]。基础研究证实[10]，强精片可改善和调节大鼠附睾功能性指标，增加附睾重量和管壁厚度，促进损伤附睾上皮恢复和上皮细胞的分泌，提高睾丸附睾器官系数，增加附睾液SA含量，降低精子膜GPC含量，从而改善附睾精子成熟功能，起到改善精子质量的作用。多项研究显示[11-12]，强精片能通过下调Fas/FasL表达，降低睾丸内ABP表达量，影响Occludin蛋白，控制支持细胞对生精细胞的凋亡诱导，调节BTB。强精片可能通过增加精子尾部鞭毛结构蛋白TUBB、DMHC7、TCTE3的表达，提高精子活力[13]。同时强精片可增加精液中TGF-β1的表达量，降低睾丸中波形蛋白的表达量，上调Cdyl、G9a表达，下调HDAC1表达，降低睾丸组织细胞凋亡率，改善模型大鼠受损睾丸结构[14-15]。

五子衍宗丸共五味药，包括五味子、枸杞子、菟丝子、覆盆子、车前子，方中枸杞子、菟丝子补肾精、壮阳道、助精神；覆盆子养真阴、固精关、起阳痿；五味子补肾水、益肺气、止遗泄；车前子利小便，与上述四子相配，补中寓泻，补而不腻。诸药相配成方，共奏补肾益精之功。

现代医学中补肾法、活血法在临床治疗男性不育症中均有较好的疗效。李海松等[16]分别采用温阳补肾、滋阴补肾、益肾填精等方法治疗男性不育症均取得令人满意的临床疗效。国医大师何任教授[17]以活血化瘀法治疗不育症亦取得较好的疗效。研究发现[18]，补肾填精、活血化瘀可改善睾丸、附睾功能及精子发生、成熟的微环境，促使缺陷精子修复为正常精子。中医学许多补肾药具有促性腺激素和性激素样作用。同时，活血药也可改善生殖器官局部的血液循环[7]。以补肾活血为治则的补肾活血育精方、益肾活血方、生精汤可明显改善肾虚血瘀型男性不育症的精子质量，有效提高精子浓度、精液量、存活率、PR和正常精子百分比，减少患者精液液化时间，降低PAS和DFI[19-21]。

精子DNA是遗传信息的载体，若精子DNA受损，将会导致精子功能和受精能力下降，甚至发生不育。对于精子DNA损伤的确切机制，目前的研究主要包括3个方面：生精过程中的细胞凋亡、运输过程中的氧自由基影响及包装过程中的染色质异常。精子DNA的损伤形式主要包括精子DNA碎片、染色质包装异常和鱼精蛋白缺乏，其中最主要的损伤形式是精子DNA碎片，包括精子DNA单链或双链的断裂。高水平的ROS影响精子细胞核中DNA的完整性。不育男性精子DNA碎片明显增多。当精子暴露于人为的ROS环境中，会造成精子DNA的氧化修饰、DNA链的断裂、交联、片段的氧化、产生游离的片段，造成缺失、DNA的染色质的重组。氧化应激与DNA链的断裂有密切关系[22]。精子DNA的损伤是多种因素共同作用的结果，主要包括生殖道的感染、肿瘤，各种化学、物理因素，生活环境及习惯，年龄以及季节温度等。临床上常见的影响精子DNA损伤的生殖系统疾病多见于精索静脉曲张、睾丸扭伤或创伤、隐睾、睾丸肿瘤、泌尿生殖系炎症等。SOD是一种含Zn、Cu的酶，是抗氧化酶中重要的一种，也是体内主要的自由基清除剂，能抑制自由基引起组织损伤的主要环节——脂质过氧化反应。因此ROS和SOD对男性不育患者精子DNA损伤有较大的参考价值。

目前临床已有多种方法可用来改善精子DNA损伤，其中比较常用的治疗方法包括抗氧化剂治疗、治疗感染、睾丸取精、精索静脉曲张手术等。抗氧化剂可以中和精液中过量的ROS，减少ROS含量，避免诱导氧化应激反应，以减少对精子DNA的损伤。研究表明，对精子DFI偏高的不育患者使用抗氧化剂治疗后，精子DFI降低，明显提高妊娠率[23]。同时现代实验研究发现，补肾药、活血药中含有很多与生精有关的微量元素，同时对氧化应激损伤也有很大改善。这可能是补肾活血法改善精子DNA损伤的机制理论依据。本次研究也证实，治疗组使用补肾补血法(强精片)治疗前DFI平均值为(25.24±9.76)%，经过3个月的治疗后，治疗组DFI平均值为(10.95±4.55)%，其DFI测值显著降低；治疗组治疗前SOD平均值为(14.19±7.15)ng/mL，治疗后治疗组SOD平均值为(28.01±11.18)ng/mL，SOD平均值较治疗前有显著提高。因补肾活血药中大部分中药成分中含有抗氧化物，可中和过多的ROS，提高SOD活性，减少氧化应激反应，故而减轻精子DNA损伤。

总的来讲，补肾活血法(强精片)可清除体内过剩的活性氧自由基，提高人体内多种抗氧化酶(包括SOD)的活性，降低体内生物分子的氧化产物(包括脂类氧化产物MDA，以及DNA和蛋白质的氧化物)，减轻精子DNA链的断裂、交联、片段的氧化及缺失，抑制氧化应激反应，改善精子DNA损伤，从而提高男性不育症患者的生育能力。