补肾活血法改善精子DNA完整性损伤临床研究

2021-08-26 03:43李俊君俞旭君
亚太传统医药 2021年8期
关键词:不育症活血平均值

李俊君,董 良,谭 琨,余 颜,俞旭君,阳 方

(成都中医药大学附属生殖妇幼医院,四川 成都 610041)

男性不育症为男科常见的疾病之一,近年来发病率不断上升,已成为一个全球化的社会性问题[1]。男性不育症可能是多种因素造成的结果,在影响人类精子发生的因素中,精液常规检查异常引发的不育已被大众熟知,但仍有检查正常的男性也存在不育。经研究发现,精子DNA损伤作为一种新的精子功能评价指标越来越受到关注[2]。

精子DNA损伤可影响精子的受精能力、受精卵的分裂以及胚胎发育,是影响生育的重要因素。DNA碎片率(DNA fragmentation index,DFI)是目前较常用于评估精子DNA完整性损伤程度的指标,当精子DNA损伤比例大于30%以上时,男性的自然生育力显著降低[3]。氧化应激是精子DNA损伤发生的一个机制。氧化应激指机体遭受各种有害刺激时,体内高活性分子如ROS和活性氮自由基(RNS)产生过多,氧化程度超出抗氧化物的清除范围,氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤。过氧化物歧化酶(SOD)是能特异性地清除ROS的一种酶,因此,SOD测定能体现精子在男性生殖道运行中氧化抗氧化的水平和能力。

中医学关于男性不育症的论述主要集中在“无嗣”“无子”等方面。对于久病之人,肾气严重亏损,无处藏精,故久病必虚,虚则血瘀,当用补肾活血之法。成都中医药大学附属医院研发的 “强精片”具有补肾强精、活血化瘀、清热利湿的功效,临床应用已达15年余。研究发现[4],该药可显著改善男性不育症患者精子动态及形态,有增加精子密度、增加精子活率及活力、改善精子形态等作用。

本文将从“强精片”入手,研究补肾活血法抗氧化作用对肾虚血瘀型男性不育症患者精子DNA损伤的影响并探索其作用机制。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准 参照《人类精子学》(2013版)、《欧洲泌尿外科学会疾病诊断治疗指南》(2014版)、《人类精液检查与处理实验室手册》(WHO第五版,2009年)以及相关试剂盒说明书等制定。(1)夫妇同居一年以上,性生活正常,未采取避孕措施,女方生殖机能正常,因男方因素造成女方不孕者。(2)实验室检查:①精子DNA碎片率(DFI)异常(正常精子DNA损伤率为0%~15%;轻度损伤:精子DNA损伤率为15%~30%;重度损伤:精子DNA损伤率为>30%)。 ②精子活性氧自由基(ROS)异常(正常测试范围:0 RLU/s-5.5RLU/s×104)。③超氧化物歧化酶(SOD)异常(正常测试范围:0.5~15 0ng/mL)。

1.1.2 中医辨证诊断标准 参照《中药新药临床研究指导原则》(2002版)、《中国中西医结合男科学》(张敏健、郭军主编,2011版)制定。主证:久婚未育,肾虚血瘀:腰膝酸软,神疲乏力,小腹隐痛(痛有定处);次证:性欲低下,头晕耳鸣,小便清长,皮下包块(瘀斑),舌质紫暗有瘀斑,脉涩或沉细。凡具备主证1项或2项、次证2项,结合舌脉改变,经两名及以上副高专业技术职称人员参与诊断,方可成立。

1.2 纳入标准

①符合西医诊断标准,并且符合中医辨证诊断标准;②不育年限达1年以上,年龄20~55岁的男性不育症患者;③DFI>15%;④无严重器质性疾病和精神、神经系统疾病;⑤患者自愿受试并签署知情同意书。

1.3 排除标准

①因女方因素导致的不能生育者;②泌尿生殖感染、激素异常、染色体核型异常及免疫性引起的男性不育;③合并有心血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病及精神病患者;④不能按规定服药,无法判断疗效或资料不全等影响疗效和安全性判断者;⑤取精困难不能满足实验室检查者。

1.4 一般资料

研究对象为2015年1月-2015年12月就诊于成都中医药大学附属医院的72例男性不育症患者,中医辨证为肾虚血瘀型,以1∶1随机分为两组。研究对象中年龄最小者22岁,最大者43岁,平均年龄(31.71±4.55)岁。

1.5 治疗方法

对照组:五子衍宗丸治疗(提供单位:成都中医药大学附属医院,每盒10袋,每袋6g),每次1袋,饭后温水吞服,1日2次。连续治疗3个月。

治疗组:强精片治疗,组方:人参、当归、枸杞子、菟丝子、淫羊藿、鹿角胶、车前子、益母草、桃仁、丹参(提供单位:成都中医药大学附属医院中药制剂中心,规格100片/瓶,每片0.3 g,每片含生药0.35 g),每次4片,饭后温水吞服,每日3次,连续治疗3个月。

1.6 观察指标

通过检测受试者服药前后精子DNA碎片率(DFI)、精子活性氧自由基(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)的变化来评价疗效。DFI检测采用深圳市博瑞德生物科技有限公司生产的精子DNA碎片检测试剂盒(商品名:SpermFuncRDNAf,产品标准号:YZB/粤0439-2010)进行检测。主要方法是利用精子染色质扩散法。ROS检测使用南京建成生物工程研究所研发的试剂盒(产品序号:E004,规格:100T-500T,产品许可证:苏ICP备12006455号),用化学发光法检测精液ROS水平。SOD变化采用ELISA生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(商品名:Human SOD ELISA kit,货号:XL-Eh1377,规格:96孔/盒,Abcam公司生产,北京永辉生物科技有限公司进口)进行检测。

1.8 统计学方法

2 结果

本研究纳入72例患者,每组各36例,试验过程中治疗组患者因工作原因脱落2例,对照组脱落3例,1例因疗效不满意终止,2例因准备试管婴儿治疗而终止。

2.1 治疗组与对照组平均年龄及不育年限分析结果

通过对两组男性年龄进行分析,t=1.16,P=0.288 3,P>0.05,因此两组年龄无统计学意义,两组具有可比性。对两组男性不育年限的数据分析,平均不育年限为(4.50±1.58)年,经分析得出两组不育年限均呈非正态性分布,故采用Z检验,Z=1.27,P=0.2679,P>0.05,提示两组平均不育年限无统计学意义,两组具有可比性。

表1 两组患者平均年龄、不育年限比较

2.2 治疗前受试者年龄与DFI、ROS、SOD相关性分析

对72例受试者年龄与DFI、ROS、SOD进行相关性线性分析,图1所示年龄与DFI,其线性拟合比率F=4.50,P<0.000 1,具有统计学意义,表明受试者年龄与DFI呈正相关;图2所示DFI与ROS,其线性拟合比率F=0.47,P<0.000 1,具有统计学意义,表明受试者ROS与DFI有相关性,二者呈正相关;图3所示ROS与SOD,其线性拟合比率F=-7.86,P<0.000 1,具有统计学意义,表明ROS与SOD有相关性,二者呈负相关。

图1 年龄与DFI相关性分析

图2 DFI与ROS相关性分析

图3 ROS与SOD相关性分析

2.3 试验后治疗组与对照组DFI、ROS、SOD比较分析

治疗组治疗前DFI平均值为(25.24±9.76),经过3个月治疗后,治疗组DFI平均值为(10.95±4.55),Z=9.272 8,P=0.004 5,P<0.05,差异具有统计学意义。对照组治疗前DFI平均值为(23.37±9.91),经过治疗后,对照组DFI平均值为(15.38±6.33),Z=8.36,P<0.000 1,差异具有统计学意义。由表2可知,试验组与对照组比较DFI显著下降。

表2 试验组、对照组治疗前后DFI值比较

表3 两组患者治疗前后ROS(RLU/s)比较

治疗组治疗前ROS平均值=(41.41±19.28)%,经过3个月的治疗后,治疗组ROS平均值为(13.74±8.88)%,Z=4.20,P=0.000 2,P<0.05,差异具有统计学意义。对照组治疗前ROS平均值=(42.91±19.74)%,经过治疗后,对照组DFI平均值为(20.37±12.65)%,Z=3.21,P=0.018 1,P<0.05,具有统计学意义。治疗组、对照组ROS平均值较治疗前有显著下降,且治疗组下降明显。

表4 治疗组、对照组治疗前后SOD比较

治疗组治疗前SOD平均值为(14.19±7.15) ng/mL,经过3个月的治疗后,治疗组SOD平均值为(28.01±11.18) ng/mL,Z=7.19,P=0.011 2,P<0.05,差异具有统计学意义。对照组治疗前SOD平均值为(15.99±6.40) ng/mL,治疗后,对照组SOD平均值为(20.20±6.25) ng/mL,Z=6.98,P<0.000 1,差异具有统计学意义。表明治疗组SOD平均值较治疗前有显著提高,且优于对照组。

2.4 中医证候评分疗效比较

两组患者经过3个月治疗后,治疗组总有效率为77.78%;对照组总有效率为66.67%,P<0.05,差异具有统计学意义。表明治疗组运用补肾活血法(强精片)能有效改善中医临床症状,且优于对照组。

表5 两组患者中医证候评分疗效比较 (n)

3 讨论

中医学认为,精子的生成依赖于肾气的温煦与滋养。肾为先天之本,是发育生殖之源。《黄帝内经》提出了以“肾”为轴心的生殖理论。《素问·上古天真论》云:“丈夫……二八,肾气盛,天癸至,精气溢泻,阴阳和,故能有子”。肾气的盛衰,天癸的有无,脏腑功能是否协调,直接决定着男性的生殖能力的强弱。故精子质量异常所致男性不育症与中医学的肾虚关系密切。瘀血作为病理产物,可因湿、热、郁煎熬日久,或壅滞血脉,滞血成瘀,或肝失疏泄,气滞阻络而成。《临证指南医案》云“凡经主气,络主血,久病血瘀”,“初为气结在经,久则血伤入络”。皆因病久气血阴阳亏虚,无力鼓动血运,血滞于经;或久病而致气机逆乱,气滞则瘀血易生。男性产精的主要器官睾丸属“阴器”,属体表络脉系统,容易因久病而气血瘀滞。《素问·调经论》云“血气不和,百病乃生”,瘀血内停,脉络瘀滞,气血不运,睾丸失养受损,肾虚精亏,发为不育。在临床中,肾虚与血瘀往往并见,但亦有肾虚为因、血瘀为果者。肾虚可分为精亏、肾气虚、肾阳虚、肾阴虚,然而无论何种肾虚,都有致瘀的可能。《内经》有“肝肾同源”之说,精之不足,无以化血,瘀血而成。故肾虚与血瘀的关系尤为密切,不能分而立论。

现代医学认为,中医理论的肾大致可以理解为现代医学的下丘脑-垂体-性腺、肾上腺组成的内分泌调节轴。精子的发生、成熟、运行以及维持正常和稳定,是通过此轴系的相互匹配、调节整合作用来实现的[5]。更有学者对中医的肾之本质进行研究,认为下丘脑-垂体-性腺轴功能失调是男性不育症的常见病因[6-7]。血在男性生殖生理中起重要作用。首先血有濡养、滋润生殖器官的作用;其次血能运输天癸以达全身,肾气足则天癸至,发挥正常的生理效应:第三,血在体内运行不息,流至精室时,在天癸作用下,可变化为精液。故唐容川在《血证论》中云:“血人丹田,亦从水化,而变为水,以其体内为血所化,故非清水,而极浓极稠,谓之肾精。”现代医学也认为正常的血液运行是生殖系统有生育能力的基本条件。

本研究使用的“强精片”由人参、当归、枸杞子、菟丝子、淫羊藿、鹿角胶、车前子、益母草、桃仁、丹参等药物组成。方中枸杞、菟丝子补肾益精,共为君药。鹿角胶、淫羊藿温补肝肾,益精养血,二者鼓舞肾中阳气,使阴得阳助,而泉源不竭;人参补气生津,丹参、桃仁、当归养血活血,气旺血行,六者合而为臣,使气血顺,阴阳调。车前子清热解毒、利尿;益母草活血化瘀,利水调经,二者共用,一泄肾中虚火,二可制约温热药物之患,三则利水消肿,使水湿得行,邪有出路。桃仁、丹参行血破瘀,使气血通畅。四者相合为佐药。纵观全方,具有“阴阳气血并调、肝肾兼顾;补中有通、补中有清”的特点。故有补肾填精、活血化瘀、清利湿热的功效,可提高男性生殖能力。

研究发现,强精片能提高精子密度、活力及活率、改善精子形态[8-9]。基础研究证实[10],强精片可改善和调节大鼠附睾功能性指标,增加附睾重量和管壁厚度,促进损伤附睾上皮恢复和上皮细胞的分泌,提高睾丸附睾器官系数,增加附睾液SA含量,降低精子膜GPC含量,从而改善附睾精子成熟功能,起到改善精子质量的作用。多项研究显示[11-12],强精片能通过下调Fas/FasL表达,降低睾丸内ABP表达量,影响Occludin蛋白,控制支持细胞对生精细胞的凋亡诱导,调节BTB。强精片可能通过增加精子尾部鞭毛结构蛋白TUBB、DMHC7、TCTE3的表达,提高精子活力[13]。同时强精片可增加精液中TGF-β1的表达量,降低睾丸中波形蛋白的表达量,上调Cdyl、G9a表达,下调HDAC1表达,降低睾丸组织细胞凋亡率,改善模型大鼠受损睾丸结构[14-15]。

五子衍宗丸共五味药,包括五味子、枸杞子、菟丝子、覆盆子、车前子,方中枸杞子、菟丝子补肾精、壮阳道、助精神;覆盆子养真阴、固精关、起阳痿;五味子补肾水、益肺气、止遗泄;车前子利小便,与上述四子相配,补中寓泻,补而不腻。诸药相配成方,共奏补肾益精之功。

现代医学中补肾法、活血法在临床治疗男性不育症中均有较好的疗效。李海松等[16]分别采用温阳补肾、滋阴补肾、益肾填精等方法治疗男性不育症均取得令人满意的临床疗效。国医大师何任教授[17]以活血化瘀法治疗不育症亦取得较好的疗效。研究发现[18],补肾填精、活血化瘀可改善睾丸、附睾功能及精子发生、成熟的微环境,促使缺陷精子修复为正常精子。中医学许多补肾药具有促性腺激素和性激素样作用。同时,活血药也可改善生殖器官局部的血液循环[7]。以补肾活血为治则的补肾活血育精方、益肾活血方、生精汤可明显改善肾虚血瘀型男性不育症的精子质量,有效提高精子浓度、精液量、存活率、PR和正常精子百分比,减少患者精液液化时间,降低PAS和DFI[19-21]。

精子DNA是遗传信息的载体,若精子DNA受损,将会导致精子功能和受精能力下降,甚至发生不育。对于精子DNA损伤的确切机制,目前的研究主要包括3个方面:生精过程中的细胞凋亡、运输过程中的氧自由基影响及包装过程中的染色质异常。精子DNA的损伤形式主要包括精子DNA碎片、染色质包装异常和鱼精蛋白缺乏,其中最主要的损伤形式是精子DNA碎片,包括精子DNA单链或双链的断裂。高水平的ROS影响精子细胞核中DNA的完整性。不育男性精子DNA碎片明显增多。当精子暴露于人为的ROS环境中,会造成精子DNA的氧化修饰、DNA链的断裂、交联、片段的氧化、产生游离的片段,造成缺失、DNA的染色质的重组。氧化应激与DNA链的断裂有密切关系[22]。精子DNA的损伤是多种因素共同作用的结果,主要包括生殖道的感染、肿瘤,各种化学、物理因素,生活环境及习惯,年龄以及季节温度等。临床上常见的影响精子DNA损伤的生殖系统疾病多见于精索静脉曲张、睾丸扭伤或创伤、隐睾、睾丸肿瘤、泌尿生殖系炎症等。SOD是一种含Zn、Cu的酶,是抗氧化酶中重要的一种,也是体内主要的自由基清除剂,能抑制自由基引起组织损伤的主要环节——脂质过氧化反应。因此ROS和SOD对男性不育患者精子DNA损伤有较大的参考价值。

目前临床已有多种方法可用来改善精子DNA损伤,其中比较常用的治疗方法包括抗氧化剂治疗、治疗感染、睾丸取精、精索静脉曲张手术等。抗氧化剂可以中和精液中过量的ROS,减少ROS含量,避免诱导氧化应激反应,以减少对精子DNA的损伤。研究表明,对精子DFI偏高的不育患者使用抗氧化剂治疗后,精子DFI降低,明显提高妊娠率[23]。同时现代实验研究发现,补肾药、活血药中含有很多与生精有关的微量元素,同时对氧化应激损伤也有很大改善。这可能是补肾活血法改善精子DNA损伤的机制理论依据。本次研究也证实,治疗组使用补肾补血法(强精片)治疗前DFI平均值为(25.24±9.76)%,经过3个月的治疗后,治疗组DFI平均值为(10.95±4.55)%,其DFI测值显著降低;治疗组治疗前SOD平均值为(14.19±7.15)ng/mL,治疗后治疗组SOD平均值为(28.01±11.18)ng/mL,SOD平均值较治疗前有显著提高。因补肾活血药中大部分中药成分中含有抗氧化物,可中和过多的ROS,提高SOD活性,减少氧化应激反应,故而减轻精子DNA损伤。

总的来讲,补肾活血法(强精片)可清除体内过剩的活性氧自由基,提高人体内多种抗氧化酶(包括SOD)的活性,降低体内生物分子的氧化产物(包括脂类氧化产物MDA,以及DNA和蛋白质的氧化物),减轻精子DNA链的断裂、交联、片段的氧化及缺失,抑制氧化应激反应,改善精子DNA损伤,从而提高男性不育症患者的生育能力。

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