正交试验优选蛇莓总酚酸提取工艺

赵鸿宾，刘晓梦，韩忠耀，李雪营，魏学军，张林甦*，余跃生

(1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558013；2.贵州医科大学第三附属医院，贵州 都匀 558000)

蛇莓为蔷薇科蛇莓属植物蛇莓(Duchesneaindica(Andr) Focke )的全草，别名“三匹风”“地莓”“一点红”“蛇含草”[1]，为民间常用草药。蛇莓性寒，味甘、苦，有小毒，入肺、肝、大肠经，具有清热解毒、消肿散瘀、收敛止血、凉血之功效，用于治疗热病惊痫、咽喉肿痛、咳嗽吐血、疔疮痈肿、蛇虫咬伤、湿疹、痢疾及烫火伤等[2-3]。近年来研究发现蛇莓不仅具有抑菌活性和抗氧化作用，而且具有较强的抗肿瘤和抗诱变活性，还能增强机体免疫功能[4-10]。在临床上，蛇莓常与其他中药配伍用来治疗妇科炎症和肿瘤[11]，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌和子宫肌瘤等。

现代药理实验研究表明，蛇莓水提取物抗肿瘤活性显著，且水提物中酚酸类成分活性较强[12-16]。然而近年对于蛇莓总酚酸提取工艺未见报道，因此本研究以酚酸类成分的提取率为评价指标，利用正交试验设计对蛇莓中酚酸类成分的提取工艺进行优化，以期促进民间常用草药的研究与开发，同时也为蛇莓产业化生产提供参考。

1 实验材料

1.1 药材与试剂

蛇莓：采自黔南民族医学高等专科学校沙木湖校区附近山坡和荒地，经魏学军教授鉴定为蔷薇科蛇莓属植物Duchesneaindica(Andr) Focke的干燥全草。

试剂：没食子酸标准品(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201605)；十二烷基磺酸钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20180919)；铁氰化钾(成都金山化学试剂有限公司)；三氯化铁(天津市大茂化学试剂厂)；甲醇、乙醇均为分析纯，蒸馏水为实验室自制双重蒸馏水。

1.2 仪器设备

Agilent Cary 100型双光束紫外可见分光光度计(北京安捷伦公司)，奥豪斯DV215CD型分析天平(奥豪斯仪器有限公司)，电热恒温干燥箱、电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备

精密称取蛇莓药材粉末1.0 g，置于锥形瓶中，精密加入一定体积的不同浓度的乙醇溶液，精密称定其总质量，在一定温度的水浴中加热回流提取1～2.5 h。待提取液冷却后称重并补足减失的重量，过滤，即得。

2.2 对照品储备液制备

精密称定没食子酸对照品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度，得到浓度为0.10 mg/mL的没食子酸对照品储备液。

2.3 总酚酸含量测定

2.3.1 没食子酸标准曲线制作 精密量取0.10 mg/mL的没食子酸储备液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，分别精密量取0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL至25 mL容量瓶中，各加甲醇5.0 mL，0.3%的十二烷基磺酸钠溶液2.0 mL，0.06%的铁氰化钾-0.9%的三氯化铁溶液(1∶1)混合溶液1.0 mL，摇匀，暗处放置5 min。加0.1 mol/L的盐酸溶液至刻度，摇匀，在暗处放置20 min。用紫外-可见分光光度计对某一浓度供试液进行全波长(400～900 nm)扫描。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到吸收曲线，确定745 nm为最大吸收波长。然后在745 nm波长下测定剩余供试液的吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度(μg/mL)横坐标，得回归方程：Y=0.552 2X+0.315 6，R2=0.998 6。数据表明没食子酸浓度在0.04～0.48 μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 精密量取0.10 mg/mL没食子酸对照品溶液6份，每份1.00 mL，分别按“2.3.1”项下方法进行显色处理，在745 nm波长下测定其吸光度。计算相对标准偏差RSD为1.2%，说明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 精密称取蛇莓干燥粉末6份，每份1.0 g，分别置于锥形瓶中，加入70%乙醇20 mL，80 ℃水浴回流提取2 h。待提取液冷却后称重，补足减失的重量，过滤。取续滤液按“2.3.1”项下方法进行显色，测定其吸光度。RSD=1.6%，说明该测定方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 精密称取1.0 g蛇莓干燥粉末，按照“2.3.3”项下方法进行提取，取续滤液分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h时按“2.3.1”项下方法进行显色，测定其吸光度。测定结果的相对标准偏差RSD为1.2%，结果表明蛇莓提取液在12 h内稳定，对测定结果无明显影响。

2.4 总酚酸提取工艺优化

2.4.1 液固比 精密称取蛇莓干燥粉末15份，每份1.0 g，分成5组，每组平行3份，各组分别按照液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1加入70%乙醇，于80 ℃水浴加热回流提取2 h。待提取液冷却后称重，补足减失的重量，过滤。取续滤液按“2.3.1”项下方法进行显色，测定其吸光度，计算总酚酸提取率。所得数据满足方差齐性要求，均值依次为1.98%、2.67%、2.95%、3.12%、3.15%，单因素方差分析结果表明组间差异显著。总酚酸提取率随着液固比变化如图1(a)所示：液固比在30∶1以上，总酚酸提取率较高。

2.4.2 乙醇浓度 按“2.4.1”项下实验分组方法，各组均按照液固比20∶1分别加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇水溶液，于80 ℃水浴加热回流提取2 h。按“2.4.1”项下方法进行后续处理，测定其吸光度，计算总酚酸提取率。总酚酸的提取率均值分别为2.45%、3.01%、2.85%、2.38%、1.87%，各测定结果均符合方差分析要求，且组间差异显著。总酚酸提取率随着乙醇浓度的变化如图1(b)所示：乙醇浓度为60%时，总酚酸提取率较高。

2.4.3 提取温度 按“2.4.1”项下分组方法，各组均按照液固比20∶1加入60%乙醇，分别于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴加热回流提取2 h。按“2.4.1”项下方法进行后续处理，测定其吸光度，计算总酚酸提取率均值分别为2.76%、2.98%、3.16%、2.93%、2.71%，结果如图1(c)所示：在80 ℃水浴条件下，总酚酸的提取率达到2.08%。数据经单因素方差分析，组间差异显著。

2.4.4 提取时间 按“2.4.1”项下分组方法，各组均按照液固比20∶1加入60%乙醇，于80 ℃水浴加热回流提取，各组提取时间按照30 min、60 min、90 min、120 min、150 min进行，按“2.4.1”项下方法进行后续处理，测定其吸光度，计算总酚酸提取率均值分别2.11%、2.58%、2.93%、3.04%、2.65%，数据经单因素方差分析显示，组间差异显著。结果如图1(d)所示：提取时间为120 min时总酚酸提取率最佳。

图1 液固比、乙醇浓度、加热温度、提取时间对总酚酸提取率的影响

2.4.5 提取次数 按“2.4.1”项下实验方法，精密称取蛇莓干燥粉末3份，每份1.0 g，按照液固比20∶1加入60%乙醇，于80 ℃水浴加热回流提取120 min，待提取液冷却后称重，补足减失的重量，过滤。将过滤后的滤渣同法提取第2、3次，分别按“2.4.1”项下方法进行后续处理，测定其吸光度，分别计算总酚酸提取率。第1、2、3次的提取率分别为2.1%、0.84%、0.51%，第2、3次提取率明显降低，从节约资源和缩短生产周期的角度考虑，选择提取1次为宜。

2.4.6 正交试验设计 依据单因素方差分析可知，液固比、乙醇浓度、提取温度、提取时间均对总酚酸提取率有显著影响，且组间差异显著，由此确定正交试验的因素和水平。L9(34)正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

2.4.7 正交试验结果及方差分析 按照L9(34)正交试验表依次进行，每个实验平行3次。试验方案及结果见表2。由表3方差分析可知，固液比(A)对总酚酸提取率影响极其显著(P<0.01)，乙醇浓度(B)对总酚酸提取率影响显著(P<0.05)，而提取温度(C)和提取时间(D)影响不显著(P>0.05)，各因素影响程度依次为：A>B>C>D。优化工艺参数为A3B2C2D2。

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

2.4.8 验证试验 在正交试验设计优化的最佳条件下，对蛇莓总酚酸进行5次平行提取试验，平均提取率为3.75%，RSD=1.41%。

3 讨论

本实验在单因素试验的基础上，通过设计4因素3水平9次正交试验得到优选的总酚酸工艺参数为液固比40∶1，乙醇浓度(V/V)60%，提取时间120 min，提取1次。按照优选的工艺参数平行提取5次，平均提取率为3.75%，RSD=1.41%，说明此工艺合理可行。

蛇莓作为贵州少数民族地区常用药材，临床应用广泛，其活性成分种类较多，尤其是黄酮类和酚酸类活性较强。但考虑到中草药的习惯用法是水煎法，其活性成分并不能有效提取，造成资源浪费。各类活性成分的药理作用也不尽相同，分别提取单一成分对提高临床用药的有效性、安全性有重要作用。本研究对提取的蛇莓总酚酸进行纯化，得到高纯度的蛇莓总酚酸，可为进一步药效学实验研究提供物质基础，促进蛇莓药用价值的发掘与利用。