谷胱甘肽对低醇玫瑰香白葡萄酒的抗氧化性

刘尚，吕文，宋茜，程鹏，崔艳

1. 天津农学院食品科学与生物工程学院，天津农产品加工工程技术中心（天津 300384）；2. 天津市利民调料有限公司（天津 300308）

白葡萄酒因其香气清爽，果香、花香浓郁，颜色较浅，更适于新鲜饮用。但一直以来白葡萄酒在原酒贮藏过程中极易发生氧化而导致其典型性香气和风味成分的损失、褐变的发生，还可能产生令人不悦的味道，大大降低白葡萄酒的饮用品质[1]。通常成品酒中的这种现象是由于酒中的酚类物质通过非酶氧化生成H2O2，引发芬顿反应从而产生氧化性极强的羟基自由基，进一步将乙醇、乙醛和酒石酸等氧化成醛酮，然后聚合导致酒体的氧化褐变[2-4]。还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合而成的活性三肽，因其分子中半胱氨酸的巯基易被氧化生成二硫键而呈现较强的还原性[5]，它可以与乙醛结合形成乙醛酸加成产物，抑制乙醛酸衍生二倍体的形成，从而阻断聚合反应，抑制葡萄酒的氧化，阻止黑色物质的产生，有效地抑制白葡萄酒的褐变[6-7]，同时在原酒贮藏期它还能起到保护芳香物质如乙酸乙酯、芳樟醇、a-松油醇等的作用[8]。因此，近年来还原型谷胱甘肽GSH在葡萄酒酿造中的应用及其替代SO2的潜能越来越多地受到国内外研究人员的关注，GSH的适度添加能够明显改善葡萄酒尤其是白葡萄酒的品质[9-10]。而低醇白葡萄酒因为酒精度低、残糖高、发酵终止困难、不耐久藏，贮藏期更易发生氧化、褐变而造成品质下降[11]。但是，到目前为止，GSH对低醇葡萄酒的影响仍鲜有报道。故试验以新鲜的低醇玫瑰香白葡萄酒为研究对象，在原酒贮藏期添加GSH，检测原酒贮藏过程中其对1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2, 2-联氮-二-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）-二铵盐（ABTS）、羟自由基（OH-）和超氧阴离子（O2-）等自由基的清除能力及酒中酚类含量和GSH残留量的变化，以评估GSH的添加在低醇白葡萄酒贮藏期间的抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

低醇玫瑰香白葡萄酒（7%，V/V，实验室自酿）。

还原型谷胱甘肽GSH（北京索莱宝科技有限公司）；2, 2-联氮-二-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）-二铵盐（ABTS）；1, 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）（上海源叶生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 试验方案

向新鲜酿造的低醇玫瑰香白葡萄原酒中分别添加0，5，10，15和20 mg/L的还原型谷胱甘肽GSH，封瓶常温储存，在添加GSH后的第1，第3，第5，第7和第9个月的贮藏过程中，分析研究GSH对该酒的抗氧化性的影响，分别检测其对DPPH、ABTS、OH-及O2-自由基的清除率。

1.2.2 低醇白葡萄酒的抗氧化性研究

1.2.2.1 对DPPH自由基的清除作用[12]

取100 μL用蒸馏水稀释30倍的酒样，加入到4 mL 6.25×10-5mol/L DPPH乙醇溶液中，反应30 min，在517 nm波长处测定吸光度。用等体积的蒸馏水加入DPPH乙醇溶液中作对照。DPPH自由基清除率按式（1）计算。

式中：As为加入酒样所测吸光度；A0为加入乙醇所得吸光度。

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1.2.2.2 对ABTS自由基的清除作用[13]

准确称取0.1920 g ABTS、0.0331 g过硫酸钾于烧杯中，用去离子水定容至50 mL，使ABTS浓度为7 mmol/L，过硫酸钾的浓度为2.45 mmol/L。将该溶液于室温暗处静置12～16 h。将配制好的ABTS自由基溶液用磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）进行稀释，直至734 nm下吸光度为0.70。取20 μL酒样，再加入2 mL ABTS反应液，振荡摇匀，室温下静置10 min，测定吸光度，以不加酒样的ABTS自由基溶液为空白对照，ABTS自由基清除率按式（2）计算。

式中：AS为样品管的吸光度；A0为对照管的吸光度。

1.2.2.3 对羟基（OH-）自由基的清除作用[14]

在测定管（A1）和对照管（A2）中分别依次加入1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1 mL酒样、1 mL 6 mmol/L双氧水，在空白管（A0）中用蒸馏水替代酒样，充分振荡后静置20 min，向A1和A0中分别加入1 mL 6 mmol/L水杨酸溶液，向A2中加入1 mL蒸馏水，充分振荡混匀后静置30 min，用紫外分光光度计测定在520 nm下的吸光度，A0，A1和A2分别表示对应管的吸光度。羟基（OH-）自由基清除率按式（3）计算。

1.2.2.4 对超氧阴离子自由基的清除作用[15]

准确称取4.5 mL 0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液，于25 ℃水浴预热20 min，加入0.1 mL酒样和0.4 mL 2.5 mmol/L邻苯三酚，混匀后在水浴中反应4 min，然后立即用2滴8 mol/L的HCl终止反应，在300 nm下测定吸光度。空白组以蒸馏水代替酒样，并按式（4）计算超氧阴离子自由基清除率。

参考王华[16]总酚含量的测定。

1.2.4 GSH含量的检测[17]

1.2.4.1 标准曲线的绘制

配制0.10 g/L GSH溶液，根据试验情况取0～1.0 mL不同体积，加水至1.0 mL，再加3 mL Tris-HCl缓冲溶液，混匀后取1.0 mL加到5 mL的DTNB溶液中，混匀并反应5 min，于412 nm测定吸光度，绘制标准曲线。

1.2.4.2 GSH含量的测定

取1.0 mL酒样，按上述DTNB法测定吸光度，由标准曲线获得GSH的含量。

1.3 统计学分析方法

使用WPS Excel 11.1.0.9339版做统计学分析。

2 结果与分析

2.1 GSH对低醇白葡萄酒中DPPH自由基的影响

由图1可以看出，GSH确实能够较有效地清除DPPH自由基。随着添加GSH处理时间的延长，DPPH自由基的清除率呈现先快速上升后逐渐降低的趋势，且所有添加GSH组均明显高于对照组的25%左右。在添加GSH处理酒样的第1个月，所有GSH组对DPPH自由基的清除率均快速上升，且不同添加量组无明显区别。在1个月时均达到最大约60%，其中10 mg/L GSH组的DPPH清除率最高（61.8%），紧随其后为15 mg/L组（61.4%）。随后1～3个月出现较快下降趋势。在第3个月时，15 mg/L GSH组清除率降低至40.96%，为最高，而5 mg/L组为GSH添加组中的最低，为35.42%。第3～第9个月逐渐趋于平稳，到第9个月，GSH添加组均降至31%左右。且在1～9个月期间15 mg/L GSH组的清除率均为最高。说明0～3个月的GSH处理时间对清除DPPH自由基的作用更强，1个月为最佳处理时间，且不同添加量仅在1个月之后才有较大差别。

图1 GSH对酒中DPPH自由基清除率的影响

2.2 GSH对低醇白葡萄酒中ABTS自由基的影响

由图2可知，添加GSH对酒中的ABTS自由基的清除率影响较大，其对ABTS自由基的清除能力远高于DPPH。图2中ABTS自由基的清除率也是随着GSH处理时间的延长先升后降，1个月时清除率达到最高值，其中15 mg/L GSH组最大（91.3%），其次为20 mg/L组（89.1%），最低为5 mg/L组（86.1%）。1个月后，清除率缓慢下降；1～3个月，清除率基本保持在80%～90%之间；且15 mg/L GSH组对ABTS的清除率始终最高；在第3个月降至85.1%，在第9个月降至57.3%。而对照组对ABTS自由基的清除率变化较小，由开始的60.3%降至最终55%左右，但第7～第9个月GSH组和对照组差异缩小。可见和对DPPH的清除作用相似，ABTS的最佳GSH处理时间也为1个月，且第1～第3个月表现较好，15 mg/L GSH组在整个过程中均保持最高的清除率。

图2 GSH对酒中ABTS自由基清除率的影响

2.3 对低醇白葡萄酒中羟基（OH-）自由基的影响

由图3可知，GSH对低醇白葡萄酒中OH-自由基的清除能力较DPPH和ABTS自由基的要高，且GSH组明显高于空白对照。可以看出在第0～第1个月，随着GSH处理时间的延长，GSH添加组对OH-自由基清除率升高，在第1个月达到最大，15 mg/L GSH组的清除率达到95.6%，随后略有下降，且该组在9个月的处理过程中，清除率始终高于90%，其他GSH组则在第7个月后清除作用下降至90%以下，此时不同的添加量组才表现出较大的差异，到第9个月清除率最低为5 mg/L组，降至86.5%。对照组起始清除率约为88%，在第9个月降至85.2%，酒体自身对羟基自由基的清除率较高。说明添加GSH对清除OH-自由基作用明显。且最佳GSH处理时间也为1个月，但该清除作用持续时间较长，当GSH添加量为15 mg/L时，清除效果最好，但在第3～第5个月，添加量的差异并不明显。

图3 GSH对酒中OH-的清除率的影响

2.4 GSH对低醇白葡萄酒中超氧阴离子自由基的影响

图4 GSH对酒中超氧阴离子清除率的影响

2.5 添加GSH对低醇白葡萄酒中总酚含量的影响

由图5可知，添加GSH对低醇玫瑰香白葡萄酒的总酚含量确实有一定的影响。由于该酒为低醇白葡萄酒，总酚的初始含量只有2.7 mg/mL。由图5可见，无论是对照组还是添加GSH组，总酚含量均呈下降趋势，其中对照组下降最多、最明显，GSH处理9个月之后，其总酚含量降至仅0.6 mg/mL，下降1.3 mg/mL。而总酚含量下降最缓慢平稳的为20 mg/L GSH组，9个月后仅降至1.7 mg/mL；其次为15 mg/L GSH组，10 mg/L GSH组和5 mg/L GSH组，说明GSH的添加量与总酚含量有密切的关系，添加GSH可抑制酒中总酚含量的下降，且随着GSH添加量增大，抑制作用增强，证实GSH具有保护酚类物质、减缓酚类物质氧化和总酚含量损失的作用，这与梁晓芳等[18]报道的GSH对于干白葡萄酒品质影响的结果相一致，也进一步验证了GSH的自由基清除能力及抗氧化性。但是也可以看出GSH添加量对总酚含量的下降的抑制作用与其清除自由基的能力并不完全一致。20 mg/L GSH组的总酚保持最多，但其他四种自由基的清除能力并不是最强。可能跟该酒中总酚含量较低有关。

图5 GSH处理期间中酒中总酚含量的变化

2.6 不同处理时间的酒样中GSH的残留量

根据前述自由基清除作用的结果，表1列出了GSH添加量为15 mg/L组的1～9个月的5个不同处理时间的酒样中，处理结束后GSH的残留量。可以看出，添加15 mg/L GSH处理后，酒样中最终的GSH残留量均高于对照组，而对照组的GSH含量也说明葡萄自身含有GSH或在葡萄酒酿造过程中是可以产生GSH的。同时，随着处理时间的延长，添加量相同的GSH在酒中的残留量是下降的，由第1个月的28.7 mg/L下降至9个月后最终的14.2 mg/L。说明无论是后添加的GSH，还是葡萄酒自身产生的GSH，在储酒的过程中均参与了酒体中的反应从而导致GSH含量的下降。可能是其与酒中的乙醛、咖啡酸、酒石酸等发生了反应生成加成产物，抑制酒体的氧化反应。同时GSH与自由基之间的反应随着处理时间延长而减少，因此后期自由基的清除率逐渐降低。这与其抗氧化性和总酚含量的变化是基本一致的。

表1 不同处理时间酒样中GSH的残留量 单位：mg/L

3 结论

经过对低醇玫瑰香白葡萄酒在原酒贮藏阶段采用GSH进行处理，结果发现GSH的添加能有效地清除该酒中的四种自由基，其自由基清除效果由高到低依次为OH-＞ABTS＞DPPH＞，其中对羟自由基和ABTS自由基的清除效果最强，超氧阴离子最弱。综合来看，四种自由基均在GSH处理1～3月内清除率较高，其中当GSH添加量为15 mg/L，处理1个月时清除率最高，抗氧化性最好。同时，GSH的添加能有效减缓该酒中总酚物质的损失，其残留量也随着处理时间延长而下降，也说明GSH可以保护酚类物质、减缓氧化速率，具有抗氧化性。此次研究可为还原型谷胱甘肽在低醇葡萄酒酿造和后期贮藏中的应用提供参考。