多发性肌炎差异表达基因的生物信息学分析

杨乐，秦超

广西医科大学第一附属医院神经内科，南宁530000

特发性炎症性肌病（IIM）是一组罕见的异质性自身免疫性疾病，主要特征是四肢近端进行性对称性肌无力、血清肌酶水平升高、肌电图呈活动性肌病改变，肌肉活检时可观察到炎症细胞浸润。根据临床病理特征，IIM可分为多发性肌炎（PM）、皮肌炎、散发性包涵体肌炎、免疫介导的坏死性肌病等亚型［1］。其中，PM是IIM中最常见的类型。据报道，PM的发病率约为2/10万，发病年龄多为30～60岁，男女比约为1∶2［2］。遗传因素参与PM的发病过程，几乎所有PM患者与HLA-DR52有关。有研究报道，PM患者肌细胞内膜可见由CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞和巨噬细胞组成的炎症细胞浸润［3］。除累及肌肉外，PM还可造成心、肺、肾等脏器受累。AIRIO等［4］研究报道，PM患者5年生存率约为75%，10年生存率约为55%，其中位生存期一般为11年。目前，PM治疗主要依靠激素和免疫抑制剂，但激素或免疫抑制剂治疗往往需要数月甚至数年，药物不良反应不可避免［5］。因此，深入探索PM的发病机制，对研发相应的靶向药物具有重要意义。本研究采用生物信息学方法筛选PM的差异表达基因（DEGs），旨在为研发相应的靶向药物提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 数据来源 登录美国国立卫生研究院旗下美国国立生物技术信息中心的GEO芯片数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“polymy⁃ositis”为检索词，获得基因表达谱GSE128470。该基因表达谱种属为人类，芯片平台为Affymetrix Human Genome U133A Array，GPL96［HG-U133A］。样本来源于肌肉组织，其中7份来自PM患者肌肉组 织 样 本（GSM3676317、GSM3676318、GSM3676319、GSM3676320、GSM3676321、GSM3676322、GSM3676323）、12份来自对照肌肉样本（GSM3676285、GSM3676286、GSM3676287、GSM3676288、GSM3676289、GSM367690、GSM3676291、GSM3676292、GSM3676293、GSM3676294、GSM3676295、GSM3676296）。

1.2 DEGs筛选 运用GEO数据库在线分析工具GEO2R对所选芯片的原始数据进行DEGs筛选，筛选条件为P<0.05且|log2FC|≥2，获取PM的DEGs。

1.3 DEGs功能注释（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路分析 将获得的DEGs输入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）在线网站，选择P<0.05且count>5的DEGs进行GO富集分析，包括生物学过程、细胞组成和分子功能，同时进行KEGG信号通路分析。

1.4 蛋白质—蛋白质相互作用（PPI）网络分析 应用STRING数据库（https：//string-db.org/）预测DEGs的PPI网络，使用Cytoscape3.8.2软件中插件MOCOD识别PPI网络中最重要的模块，并对模块中的DEGs进行GO富集分析和KEGG信号通路分析，筛选条件为P<0.05且count>5。

1.5 关键基因筛选 采用Cytoscape3.8.2软件中的插件CytoHubba并以degree为标准，筛选PPI网络中前十位的DEGs并作为关键基因。

2 结果

2.1 DEGs筛选结果 通过GEO2R在线分析工具，以P<0.05且|log2FC|≥2为筛选条件，从基因表达谱GSE128470中共筛选出366个PM相关的DEGs，其中表达上调基因331个、表达下调基因35个。

2.2 DEGs的GO富集分析结果 GO富集分析显示，DEGs主要涉及的生物学过程：干扰素γ介导的信号通路、免疫反应、炎症反应、抗原加工和呈递、先天性免疫反应、通过Ⅱ类MHC进行抗原加工和肽或多糖抗原呈递、通过Ⅰ类MHC进行抗原加工和肽抗原呈递、防御病毒、T细胞受体信号通路、调节免疫反应、趋化性、细胞对肿瘤坏死因子反应、经由TAP依赖的MHCⅠ类进行抗原加工和呈递外源性肽抗原、细胞增殖调节、细胞黏附、受体介导的内吞作用；细胞组成：内质网膜腔侧的组成部分、细胞外空间、细胞外泌体、MHCⅡ类蛋白复合物、质膜、细胞表面、内质网至高尔基体运输小泡膜、细胞外区域、细胞质的核周区域、质膜的组成部分、胞质溶胶、内质网；分子功能：肽抗原结合、MHCⅡ类受体活性、趋化因子活性、抗原结合、免疫球蛋白受体结合、蛋白质结合、肝素结合、丝氨酸型内肽酶活性、蛋白质结合、蛋白质均二聚活性、整联蛋白结合、受体结合。

2.3 DEGs的KEGG信号通路分析结果 KEGG信号通路分析显示，DEGs主要涉及的信号通路：抗原处理和呈递、吞噬体、同种异体移植排斥、细胞黏附分子（CAMs）、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、金黄色葡萄球菌感染、自身免疫性甲状腺疾病、产生IgA的肠道免疫网络、自然杀伤细胞介导的细胞毒性。

2.4 PPI网络构建和核心模块 采用STRING数据库构建DEGs的PPI网络，使用Cytoscape3.8.2软件中插件MOCOD识别PPI网络中最重要的模块，见图1。GO富集分析显示，该模块中的基因主要参与的生物学过程：干扰素γ介导的信号通路、Ⅰ型干扰素信号通路、抗原加工和呈递、免疫反应、经由TAP依赖的MHCⅠ类进行抗原加工和呈递外源性肽抗原、通过Ⅰ类MHC进行抗原加工和肽抗原呈递、通过Ⅱ类MHC进行抗原加工和肽或多糖抗原呈递、T细胞受体信号通路；细胞组成：内质网膜腔侧的组成部分、内质网至高尔基体运输小泡膜、MHCⅡ类蛋白复合物、高尔基体膜、细胞表面、转运囊泡膜、网格蛋白包被的内吞囊泡膜、吞噬小泡膜、内吞小泡膜、溶酶体膜；分子功能：肽抗原结合、MHCⅡ类受体活性、受体结合。KEGG信号通路分析显示，该模块中的基因主要参与同种异体移植排斥、EB病毒感染、CAMs、抗原处理和呈递、吞噬体、金黄色葡萄球菌感染、产生IgA的肠道免疫网络、炎症性肠病。

图1 DEGs中核心模块的PPI网络

2.5 关键基因筛选结果 PPI网络中前十位的DEGs作为关键基因，分别为PTPRC、STAT1、CD44、VCAM1、ICAM1、IRF8、IRF1、ITGB2、TYROBP、HLADRB1。

3 讨论

PM是一组由多种原因引起的，以骨骼肌间质性炎性改变和肌纤维变性为特征的自身免疫性疾病，除累及肌肉组织外，还可引起其他脏器或组织受累。PM晚期可累及食管，导致患者吞咽困难，进而引起反流性食管炎，有可能导致吸入性肺炎甚至窒息［6］。PM患者血液往往处于高凝状态，血栓栓塞的发生风险明显增加［7］。此外，PM患者罹患心脏病、恶心肿瘤的风险亦明显增加。目前，临床主要通过血清学检查、影像学和肌电图检查、神经传导检查以及组织活检等方法诊断PM，但没有特定的检查方法和靶向药物。

本研究从GEO芯片数据库中获取PM患者和健康人群肌肉组织的基因芯片（GSE128470），筛选得到366个DEGs，其中表达上调基因331个、表达下调基因35个。通过DAVID在线网站进行GO富集分析和KEGG信号通路分析。GO富集分析显示，DEGs的主要功能涉及干扰素γ介导的信号通路、免疫反应、炎症反应、内质网膜腔侧的组成部分、肽抗原结合、MHCⅡ类受体活性、趋化因子活性等；KEGG信号通路分析显示，DEGs主要富集在抗原处理和呈递、吞噬体、同种异体移植排斥、CAMs、细胞因子与细胞因子受体的相互作用等。通过STRING数据库构建了DEGs的PPI网络，使用Cytoscape软件中插件MOCOD识别PPI网络中的核心模块，并对模块中的基因进行GO富集分析和KEGG信号通路分析。GO富集分析发现，核心模块中的基因主要功能涉及干扰素γ介导的信号通路、内质网膜腔侧的组成部分、肽抗原结合等；KEGG信号通路分析发现，核心模块中的基因主要富集在同种异体移植排斥、CAMs等。本研究最后采用Cytoscape软件中的插件CytoHubba，筛选出了PPI网络中排名前十位的关键基因，分别为PTPRC、STAT1、CD44、VCAM1、ICAM1、IRF8、IRF1、ITGB2、TYROBP、HLA-DRB1。

STAT1的编码蛋白可被干扰素α、干扰素γ等激活，该蛋白能够介导多种基因的表达［8］。有研究表明，PM患者STAT1表达明显高于健康志愿者，可能是因为STAT1参与了JAK-STAT信号传导系统，从而形成转录激活因子干扰素α活化因子和干扰素刺激基因因子3，这两个转录激活因子转移至细胞核内与干扰素刺激应答原结合，诱导靶基因转录，从而参与组织损伤［9］。VCAM1的编码蛋白可介导白细胞—内皮细胞黏附和信号转导，并可在动脉粥样硬化和类风湿关节炎中发挥作用［10］。ICAM1可编码在内皮细胞和免疫细胞上表达的细胞表面糖蛋白［11］。有研究发现，ICAM1和VCAM1在PM患者肌内膜毛细血管内皮细胞中表达上调，并作为白细胞功能相关抗原1和极晚激活抗原4的配体发挥作用，从而使活化的淋巴细胞黏附于内皮细胞并迁移至肌肉纤维［12］。HLA-DRB1属于HLAⅡ类β链旁系同源物，其编码蛋白可通过呈现源自细胞外蛋白的肽，在免疫系统中发挥重要作用［13］。HLA在PM的发病中发挥重要作用，这可能是因为HLA分子能够影响T细胞受体发育、外周耐受以及对环境因子的免疫反应等［14］。

目前，PTPRC、CD44、IRF8、IRF1、ITGB2、TYROBP与PM的相关研究较少。PTPRC编码蛋白酪氨酸磷酸酶，蛋白酪氨酸磷酸酶是调节多种细胞过程的信号分子，如细胞有丝分裂、致癌转化，还是T、B细胞抗原受体信号转导的重要调节剂［15］。CD44的编码蛋白能够参与细胞—细胞相互作用、细胞黏附和细胞迁移等，该蛋白还能参与淋巴细胞活化、再循环和归巢以及肿瘤转移等生物学过程［16］。IRF8编码IRF家族蛋白，该家族蛋白可与干扰素刺激的反应元件结合，调节Ⅰ型干扰素（干扰素α、干扰素β）分泌［17］。人类IRF8缺失会导致严重的原发性免疫缺陷，其附近序列变异是炎症性肠病、类风湿关节炎、多发性硬化症等多种慢性炎性疾病发生的重要危险因素。IRF1的编码蛋白是一种转录调节因子或肿瘤抑制因子，也是与先天性和后天性免疫应答有关基因的激活剂，该蛋白能够在细胞增殖、凋亡以及免疫反应和DNA损伤反应中发挥作用［18］。ITGB2的编码蛋白在免疫应答中起重要作用，该基因缺陷可导致白细胞黏附障碍［19］。TYROBP的编码蛋白可能与膜糖蛋白的杀伤细胞性抑制受体家族有关，并且可以充当激活信号转导元件，在信号转导、脑髓鞘形成和炎症反应中发挥重要作用［20］。

本研究从PM患者肌肉组织中共筛选出366个DEGs，其中表达上调基因331个、表达下调基因35个，这些DEGs主要参与抗原处理和呈递、免疫反应、吞噬体、CAMs等信号通路，其中PTPRC、STAT1、CD44、VCAM1、ICAM1、IRF8、IRF1、ITGB2、TY⁃ROBP、HLA-DRB1为PM的关键基因。这些关键基因有可能成为PM早期诊断、靶向治疗和预后评估的分子标志物。