快速样品处理技术结合高效液相色谱法测定水果和蔬菜中除虫脲

赵雪宁，雷浩，高勤叶，贺习文

（陕西秦云农产品检验检测股份有限公司，陕西渭南 714000）

除虫脲是一种特异性低毒杀虫剂，属于苯甲酸基苯基脲类，主要作用是抑制昆虫表皮的几丁质合成，同时对脂肪体、咽侧体等内分泌和腺体有损伤作用，从而阻碍昆虫蜕皮变态［1–4］。

除虫脲广泛应用于苹果、梨、柑橘等果树，也用于茄果类、瓜类等蔬菜。除虫脲的代谢产物氯苯胺和对氯苯基脲已被证明具有一定的毒性，同时除虫脲具有致突变作用［5–8］，长期服食残留有除虫脲的果蔬，会直接影响人的身体健康。

目前检测果蔬中除虫脲的手段主要为液相色谱–串联质谱法。武源［9］等基于QuEChERS液相色谱–串联质谱法测定茶叶中除虫脲并进行了测量不确定度的评定；吴迟［10］等采用高效液相色谱–串联质谱法测定甘蓝中甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和除虫脲的含量；也有测定韭菜及茶叶中除虫脲残留量的相关报道［11–13］。液相色谱–串联质谱法优点是检出限低、定性准确，缺点是检测成本高，难以满足对除虫脲进行定性、定量检测的日常需要。除此之外，使用高效液相色谱法和酶联免疫法检测部分水果蔬菜中除虫脲残留量也有报道［14–21］。

笔者采用高效液相色谱法对多种水果和蔬菜中的除虫脲含量进行测定，同时使用N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（Carbon-GCB）、C18填料等净化材料对样品提取液中的杂质进行净化，在不同基质的果蔬样品中均得到较高的加标回收率，净化效果理想，方法精密度高，操作简便，检测成本低，适合日常对果蔬中除虫脲残留量的筛查和检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Ultimate 3000型，美国赛默飞世尔科技公司。

电子天平：（1）MS205DU型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多集团；（2）CP224C型，感量为0.1 mg，奥豪斯仪器（常州）有限公司。

离心机：H1850型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

涡轮混合器：XW–80A型，大龙兴创实验仪器（北京）股份有限公司。

超声波提取仪：KQ–100DB型，超声功率为40 kHz，容量为4 L，昆山市超声仪器有限公司。

除虫脲标准物质：纯度（质量分数）为98.8%，阿尔塔科技有限公司。

乙腈：HPLC级，美国Sigma公司。

N-丙基乙二胺（PSA）：规格为10 g，粒径为40～63 μm，德国CNW Technologies GmbH公司。

石墨化炭黑（Carbon-GCB）：规格为10 g，粒径为38～120 μm，德国CNW Technologies GmbH公司。

键合硅胶C18填料：规格为10 g，粒径为40～60 μm，德国CNW Technologies GmbH公司。无水硫酸镁：分析纯，天津市大茂化学试剂厂。苹果、梨、柑橘、土豆、南瓜、白菜等果蔬样品：市售。

实验用水为一级水。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

除虫脲标准贮备液：1 000 μg／mL，准确称取除虫脲标准物质0.010 00 g，置于10.0 mL棕色容量瓶中，用乙腈超声溶解，并定容至标线。

除虫脲标准溶液：质量浓度分别为100、10 μg／mL，以乙腈稀释除虫脲标准贮备液制得。

1.2.2 样品处理

将样品用破壁机进行粉碎，制成混合均匀的试样，称取试样2.5 g于50 mL具塞离心管中，准确加入10.0 mL乙腈，涡轮混合3 min，超声提取10 min，静置浸泡20 min，以8 000 r／min转速离心3 min，取上清液5 mL于10 mL离心管中，加入200 mg PSA、50 mg Carbon-GCB、0.5 g无水硫酸镁、200 mg C18填料，涡轮混合30 s，静置后取上清液，过0.45 μm滤膜后上机测定。

1.2.3 色谱条件

色 谱 柱：Kromasil 100–5–C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典阿克苏诺贝尔公司）；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：257 nm；流动相：乙腈–水（体积比为55∶45）；柱温：35 ℃；进样体积：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 检测波长

将质量浓度为10 μg／mL的除虫脲标准溶液在配备二极管阵列检测器的高效液相色谱仪上进行紫外全波长扫描，扫描后得到的紫外吸收光谱图如图1所示。除虫脲在193 nm和257 nm处有吸收峰，试验发现193 nm虽然响应值较高，但杂峰比257 nm处更多，影响目标峰的积分和计算，故选择检测波长为257 nm。

图1 除虫脲紫外吸收光谱图

2.1.2 色谱柱

选择最为常见的反相填料C18色谱柱，通过调节流动相配比等参数来达到最佳的分离效果和保留效果。分别采用美国赛默飞世尔科技公司生产的Hypersil GOLD C18型色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和瑞典阿克苏诺贝尔公司生产的Kromasil 100–5–C18型色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行比较试验，结果表明Kromasil 100–5–C18柱具有更好的保留效果和色谱峰形，因此选用Kromasil 100–5–C18色谱柱。

2.1.3 流动相组成及配比

非极性固定相的色谱柱，常用的流动相有机组分有甲醇和乙腈，因为甲醇在低波长有较大吸收，可能造成溶剂干扰，因此有机相选用乙腈。

分 别 使 用 体 积 比 为50∶50、55∶45、60∶40、65∶35、70∶30的乙腈–水作为流动相进行试验，结果表明，随着乙腈体积分数增加，目标物保留时间持续缩短，色谱峰更加尖锐。综合考虑实验效果和成本，最终确定乙腈–水的体积比为55∶45。

2.1.4 柱温

分别选择柱温为25、30、35、40、45 ℃进行试验，结果表明柱温为35℃时分离效果最佳，故选择柱温为35 ℃。

2.2 样品处理

2.2.1 称样质量

测试了不同称样质量对测定结果的影响，以苹果样品为例，依次称取苹果试样1、2.5、5、10 g，向每份样品中加入相同含量的除虫脲标准溶液，按照1.2.2方法处理并测定。结果表明，当称样质量为5、10 g时，涡旋时无法充分混匀，超声提取效果不佳，回收率相对较低；当称样量为1、2.5 g时，提取效果较好，回收率均在90%以上。最终选择称样质量为2.5 g。

2.2.2 提取溶剂

利用加标样品，分别试验了甲醇、乙腈、二氯甲烷及二氯甲烷–石油醚（体积比为3∶4）4种不同溶剂的提取效果，结果表明甲醇提取效果最差（回收率为50%～70%）；二氯甲烷的提取效果优于甲醇，但低于乙腈、二氯甲烷–石油醚混合溶液；而石油醚挥发性强，毒性和刺激性气味较大；乙腈对除虫脲具有良好的溶解性，能够满足对除虫脲的提取要求。综合考虑，确定使用乙腈作为提取液。

2.2.3 提取时间

利用加标样品，分别选择不同的超声提取时间和浸泡时间进行试验，结果表明当超声提取时间低于5 min时，提取效果较差；当超声提取时间为5～10 min时，样品中添加的除虫脲基本能够完全提取。为了实现更好的提取效果，选择将样品超声提取10 min，同时静置浸泡20 min。

2.2.4 净化材料

考虑到样品基质的复杂性，依次采用PSA填料、C18填料、硅酸镁填料、中性氧化铝填料及PSA–C18、PSA–硅酸镁、PSA–中性氧化铝组合材料进行试验，考察对样品基质的吸附效果，试验结果表明PSA–C18填料净化效果最佳，能够消除大部分基质样品中的杂质峰干扰，同时加入Carbon-GCB去除色素，加入无水硫酸镁除去水分，能够得到较好的色谱峰形和回收率。

2.3 线性关系

取除虫脲标准溶液适量，以乙腈稀释，分别配制 成 质 量 浓 度 为0.01、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg／mL的系列标准工作溶液，按1.2.3中色谱条件上机测定，以溶液的质量浓度为自变量、对应的色谱峰面积为因变量进行线性回归，得线性方程：Y=55 343X–1 200，相关系数（r）为1.00，表明除虫脲的质量浓度在0.01～50 μg／mL范围内线性良好。

2.4 检出限和定量限

分别将3倍、10倍信噪比对应的除虫脲标准溶液浓度换算成样品中除虫脲的质量分数，作为方法检出限、定量限，所得不同基质样品中除虫脲的检出限和定量限列于表1。

表1 不同果蔬样品中除虫脲的检出限和定量限

由表1可知，土豆、南瓜、苹果等果蔬中除虫脲的检出限为0.05 mg／kg，定量限为0.15 mg／kg；蒜苗、韭菜、柑橘等含有挥发性成分的果蔬，检出限为0.06 mg／kg，定量限为0.20 mg／kg。

2.5 方法精密度

选取部分空白基质样品进行加标试验，每组进行6次平行试验，以色谱保留时间计算定性重复性，以色谱峰面积计算定量重复性，所得结果列于表2。从表2可知，7种不同基质的空白样品中，除虫脲的定性重复性相对标准偏差均小于0.2%，定量重复性相对标准偏差均不大于3.0%，表明方法精密度良好，满足定性和定量要求。

表2 方法精密度试验结果

2.6 加标回收率

选取具有代表性的11种不同基质的样品，分别进行加标回收试验，测定值及计算结果列于表3。

表3 加标回收试验结果

由表3可知，加标量分别为1倍检出限、1倍定量限、3倍定量限时，11种不同果蔬样品中除虫脲的加标回收率均大于85%，不同加标浓度回收率为87.8%～110.0%，满足检测要求。

油麦菜加标样品色谱图如图2所示。由图2可知，使用优化后的仪器条件和加入净化材料吸附杂质后，目标峰与样品基质分离效果良好，目标峰峰形对称，可以实现准确定量。

图2 加标油麦菜样品色谱图

2.7 方法比对

选取一份已知除虫脲含量的质控样品，使用GB／T 5009.147—2003法对该样品进行多次测试，测定平均值为2.36 mg／kg，使用本方法检测结果为2.32 mg／kg，测量偏差为0.04 mg／kg，在标准允许范围内，证明本方法与标准检测结果基本吻合。

3 结语

将水果和蔬菜样品净化后采用高效液相色谱法对样品中除虫脲含量进行测定，方法精密度和准确度满足技术要求，该方法操作简便，检测速度快，检验成本低，可用作水果和蔬菜中除虫脲残留量检测的常规分析方法。