沉默TRIM31基因表达通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制膀胱癌细胞的迁移与侵袭①

徐兵 李勇 刘明 刘永辉（南华大学附属第三医院泌尿外科，衡阳421900）

膀胱癌是一种泌尿系统肿瘤，位居全球男性最常见癌症的第7位，四分之三的病例发生于男性，但近年来，其在女性中的发病率和死亡率也呈明显上升趋势［1-2］。膀胱癌具有易转移、易复发特点，转移性膀胱癌一直以来都是临床上难以解决的问题，死亡率较高［3］。上皮-间质转化（epithelial mesenchy‑mal transition，EMT）是肿瘤细胞侵袭和转移的关键性过程，在膀胱癌进展中发挥重要作用［4］。因此，调控EMT，抑制膀胱癌细胞的侵袭与转移，将为膀胱癌的治疗提供更多可能。三结构域蛋白31（tripar‑tite motif containing 31，TRIM31）是含trip基因序列蛋白家族的一员，具有E3泛素连接酶活性，广泛参与机体生物学和病理过程。TRIM31在多种癌症中表达上调，且过度表达可促进肿瘤细胞的恶性行为，增强肿瘤的侵袭能力［5-6］。蔡坤等［7］发现，沉默胰腺癌细胞中TRIM31的表达可抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。有研究显示，TRIM31是正常人与膀胱癌患者间的差异表达基因之一，在膀胱癌中呈高表达［8］。但关于TRIM31在膀胱癌中的作用，对膀胱癌细胞迁移、侵袭及EMT的影响却鲜有报道，故本研究通过体外实验，观察沉默TRIM31基因表达对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响，并初步阐明其作用机制，以期为临床靶向治疗膀胱癌提供更多理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料人膀胱癌细胞系5637和T24均购自中国科学院细胞库；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine®NAiMAX、TRIzol购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司；SYBR Green PCR试剂盒购自美国KAPA Biosystems公司；Matri‑gel胶购自美国BD公司；小鼠抗人TRIM31多克隆抗体、兔抗人β-连环蛋白（β-catenin）多克隆抗体、兔抗人基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）多克隆抗体、兔抗人MMP-9多克隆抗体、兔抗人波形蛋白（Vimentin）多克隆抗体、兔抗人上皮钙依赖黏附蛋白（E-cadherin）单克隆抗体、兔抗人Snail1多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体、山羊抗兔IgG抗体和山羊抗小鼠IgG抗体均购自英国Abcam公司；化学发光试剂、PVDF膜购自美国Milli‑pore公司；TRIM31 siRNA和阴性对照片段（NC）由北京华大基因设计合成；倒置荧光显微镜购自德国徕卡公司；荧光定量PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司；Transwell培养小室购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染从液氮罐中取出人膀胱癌5637和T24细胞，37℃水浴融化冻存液，1 000 r/min离心3 min，弃上清，加入1 ml DMEM重悬细胞沉淀。转移至培养瓶中，再加入4 ml含10%胎牛血清的新鲜DMEM，于37℃、5%CO2培养箱中传代培养。取对数生长期的5637和T24细胞，以2×105个/孔分别接种于6孔板，待细胞融合度达到80%时，将细胞分为对照组、siRNA-NC组和siRNATRIM31组，采用Lipofectamine®RNAiMAX转染试剂将TRIM31 siRNA和NC分别转染至细胞，转染48 h后收集细胞沉淀检测TRIM31 mRNA和蛋白表达水平，以验证转染效果。

1.2.2 qRT-PCR检测细胞中TRIM31 mRNA表达水平取各组细胞沉淀，TRIzol法提取细胞总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，利用SYBR Green PCR试剂盒进行PCR扩增检测。反应条件：94℃2 min；98℃变性10 s，54℃退火15 s，68℃延伸1 min，35个循环；72℃7 min。以下为引物序列，TRIM31 F：5'-GTCTTGTGCAGAAGTGAAGAGTT-3'，R：5'-TCACAAAACCAAGCCCGGAT-3'；GAPDH F：5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3'，R：5'-AGTAC-TTGCGCTCAGGAGGA-3'。以GAPDH为内参，采用2-∆∆Ct方法计算TRIM31 mRNA相对表达量。

1.2.3 Transwell检测细胞迁移与侵袭消化转染后的细胞，用不含血清的DMEM饥饿处理12 h。制作单细胞悬液，稀释至浓度为1×105个/ml，接种于Transwell小室，每小室含0.5 ml细胞悬液，下层24孔板中加入0.75 ml含10%胎牛血清的培养液，继续培养24 h。加入1 ml 4%甲醛固定10 min，再加入1 ml 0.5%结晶紫溶液染色30 min。PBS洗涤3次，室温晾干，擦去Transwell小室中没有迁移的细胞，于显微镜下随机取5个视野观察细胞迁移情况并计数。侵袭实验时，需在Transwell小室上室底部铺设Matrigel胶，其他步骤与迁移实验一致。

1.2.4 免疫荧光染色观察β-catenin蛋白核转位水平用胰酶消化各组细胞，制成单细胞悬液，以2×105个/孔接种于6孔板（孔内加入玻片），置于培养箱中培养24 h。弃培养液，加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗后，加入0.5%Triton X-100通透20 min，加入5%封闭液封闭1 h。PBS清洗，加入兔抗β-catenin抗体稀释液（1∶500），37℃孵育1 h。PBS洗涤3次，加入经荧光标记的二抗稀释液，37℃孵 育30 min，PBS洗涤3次，滴加DAPI避光孵 育10 min，PBS洗涤3次，再滴加抗荧光淬灭封片液，取一块干净的载玻片，吸取多余的液体，细胞面朝下贴于载玻片上，显微镜观察染色情况。

1.2.5 Western blot检测细胞中蛋白表达水平取各组细胞沉淀，采用RIPA裂解液提取细胞蛋白，经BCA法测蛋白浓度后，取20µg蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳分离。湿转法将蛋白转印至PVDF膜，37℃封闭1 h。加入一抗稀释液TRIM31（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、MMP-2（1∶2 000）、MMP-9（1∶1 000）、Vimentin（1∶2 000）、E-cadherin（1∶1 000）、Snail1（1∶500）和GAPDH（1∶1 000），4℃孵育过夜。PBS清洗3次，加入二抗稀释液［经HRP标记的IgG（1∶10 000）］，室温孵育1 h，PBS清洗3次。加入化学发光试剂，于凝胶成像系统中曝光显影，分析各蛋白条带灰度值，计算蛋白质相对表达量。

2 结果

2.1 siRNA沉默膀胱癌细胞中TRIM31基因表达

qRT-PCR（图1A）和Western blot（图1B）检测结果显示，与对照组相比，siRNA-NC组T24细胞和5637细胞中的TRIM31mRNA及蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；与siRNA-NC组相比，siRNATRIM31组T24细胞和5637细胞中的TRIM31mRNA及蛋白表达水平均降低（P<0.01），证实本研究成功获得TRIM31基因沉默的膀胱癌细胞株。

图1 TRIM31基因沉默对T24和5637细胞中TRIM31 mRNA和蛋白表达的影响Fig.1 Effect of silencing TRIM31 gene on mRNA and pro⁃tein expressions of TRIM31 in T24 and 5637 cells

2.2 沉默TRIM31基因对膀胱癌细胞迁移与侵袭的影响Transwell检测结果显示，与Control组相比，siRNA-NC组T24和5637细胞迁移和侵袭细胞数差异无统计学意义（P>0.05）；与siRNA-NC组相比，siRNA-TRIM31组T24和5637细胞迁移和侵袭细胞数减少（P<0.01，图2、3）。Western blot结果显示，与Control组相比，siRNA-NC组T24和5637细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；与siRNA-NC组相比，siRNA-TRIM31组T24和5637细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显降低（P<0.01，图4）。

图2 TRIM31基因沉默对T24和5637细胞的迁移的影响（×200）Fig.2 Effect of silencing TRIM31 gene on migration of T24 and 5637 cells（×200）

图4 TRIM31基因沉默对T24和5637细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响Fig.4 Effect of silencing TRIM31 gene on protein expres⁃sions of MMP-2 and MMP-9 in T24 and 5637 cells

2.3 沉默TRIM31基因对膀胱癌细胞β-catenin蛋白核转位的影响免疫荧光染色结果显示，对照组和siRNA-NC组T24和5637细胞中β-catenin蛋白荧光在细胞核中高密度聚集，在细胞质中也有大量表达；而siRNA-TRIM31组T24和5637细胞中β-catenin蛋白荧光在细胞核和细胞质中均较弱（图5）。

图3 TRIM31基因沉默对T24和5637细胞的侵袭的影响（×200）Fig.3 Effect of silencing TRIM31 gene on invasion of T24 and 5637 cells（×200）

图5 免疫荧光染色观察T24和5637细胞中β-catenin蛋白定位（×400）Fig.5 Location of β-catenin protein in T24 and 5637 cells was observed by immunofluorescence（×400）

2.4 沉默TRIM31基因对膀胱癌细胞EMT相关蛋白及Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响与对照组相比，siRNA-NC组T24和5637细胞中βcatenin、Snail1、Vimentin和E-cadherin蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；与siRNA-NC组相比，siR‑NA-TRIM31组T24和5637细胞中β-catenin、Snail1和Vimentin蛋白表达水平降低（P<0.01），而E-cad‑herin蛋白表达水平升高（P<0.01，图6）。

图6 Western blot检 测T24和5637细 胞 中β-catenin、Snail1、Vimentin和E-cadherin蛋白表达水平Fig.6 Expressions of β-catenin，Snail1，Vimentin and Ecadherin in T24 and 5637 cells were detected by Western blot

3 讨论

EMT发生在多种生理和病理条件下，由一组保守的诱导信号、转录调节因子和下游效应器驱动而成［9］。良性肿瘤向侵袭性增强表型进展的过程很大程度依赖于EMT的激活，调控EMT过程对肿瘤的治疗及控制转移具有重要作用［9-10］。膀胱癌是男性最常见的癌症之一，抑制膀胱癌细胞的迁移、侵袭和EMT成为治疗膀胱癌的新策略之一［11］。EMT相关标记蛋白包括E-cadherin、Vimentin和Snail1等［12］。研究发现，上调上皮质性标志物（E-cadherin），下调间质性标志物（Vimentin）可抑制肿瘤细胞的侵袭能力［13］。在肿瘤的发生发展过程中，多种信号通路可通过诱导EMT转录因子（如Snail1）的表达而触发EMT，最终促进肿瘤的侵袭、转移和耐药，当Snail1表达被抑制后则无法执行下游的信号传导，从而调控EMT过程［14］。SALEHI等［15］认为Snail1在膀胱癌的发生、发展中起重要作用，可作为浸润性膀胱癌靶向治疗的潜在靶点，当沉默膀胱癌细胞中Snail1表达时，Vimentin、MMPs均表达下调，E-cadherin表达上调，细胞迁移能力减弱。本实验中Transwell检测结果显示，当下调膀胱癌T24和5637细胞中TRIM31表达时，发生迁移与侵袭的T24细胞和5637细胞数量均明显少于对照组和空载组，说明沉默TRIM31表达可抑制膀胱癌细胞的迁移与侵袭能力。进一步检测EMT相关蛋白表达水平，结果显示，与对照组或空载组相比，TRIM31干扰组T24细胞和5637细胞中Vimentin与Snail1蛋白表达水平明显降低，E-cadherin表达水平明显升高，提示沉默膀胱癌细胞中TRIM31表达，可抑制肿瘤细胞EMT过程，从而影响膀胱癌细胞的迁移与侵袭能力。

Wnt/β-catenin信号通路可作为诱发EMT的因素之一，是EMT过程中重要的信号通路之一，抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性可逆转肿瘤细胞的EMT，进而降低肿瘤的侵袭性［16-17］。β-catenin是介导细胞膜到细胞核间信号传导的中心分子，当βcatenin从细胞质转移到细胞核时，激活下游靶基因（Snail1、MMP-2、MMP-9等）。ZHANG等［18］研究结果显示，沉默膀胱癌细胞中β-catenin的表达，可通过Wnt/β-catenin信号通路逆转EMT，进而抑制膀胱癌细胞的转移与侵袭。SHI等［19］研究也发现抑制Wnt/β-catenin信号通路后，MMP-2和MMP-9表达降低，影响EMT的发生。有研究发现，敲除TRIM31基因可抑制急性髓系白血病细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而调控细胞的增殖、凋亡和耐药性［20］。本实验结果与上述研究发现基本一致，TRIM31基因在膀胱癌细胞中亦可调控Wnt/β-catenin信号通路的激活，当沉默T24细胞和5637细胞中TRIM31基因的表达，β-catenin表达减少，下游靶基因Snail1、MMP-2和MMP-9的表达也明显减少。本研究结果提示，抑制膀胱癌细胞中TRIM31基因的表达可抑制Wnt/β-catenin信号通路以及下游靶基因的表达水平，进而调控膀胱癌细胞EMT。

综上所述，沉默TRIM31可抑制膀胱癌细胞的迁移与侵袭，其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路抑制膀胱癌细胞的EMT过程有关，推测TRIM31可能是膀胱癌治疗的潜在靶点。本研究结果为膀胱癌靶向治疗奠定了一定的实验基础，后续还将进一步从体内实验进行验证。