基于AhR信号通路探讨PM2.5暴露及BV治疗对小鼠气道炎症的作用及机制

陈子琦 沈暘 胡国华 柯霞洪 苏玲 康厚墉

（重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，重庆400016）

颗粒物（PM）是我国现代社会最严重的环境问题之一［1］。PM2.5是指空气动力学直径≤2.5µm的细颗粒物，是中国空气污染的主要成分，且平均浓度具有空间自相关性［2-3］。PM2.5表面可吸附各种有毒物质，进入呼吸道后主要沉积于气管支气管区域，对人体各器官造成不同程度损伤。PM2.5的致毒性是颗粒物和吸附的有毒污染物的综合作用，如生物成分（内毒素、花粉、真菌孢子、病毒和细菌）、颗粒物、多环芳烃（PAHs）、挥发性有机化合物（VOCs）和重金属［4］。大量研究显示，PM2.5暴露与多种呼吸系统、循环系统及代谢系统疾病有关，如气道过敏性疾病、急性呼吸道感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、糖代谢异常、血压异常等［5-7］。国内一项研究证明，低浓度PM2.5暴露可增加65岁及以上老年人死亡风险［8］。OGINO等［9］研究表明，PM2.5可诱导小鼠哮喘样气道炎症，鼻内滴注PM2.5悬液可诱导小鼠气道炎症反应。此外，WANG等［10］研 究 发 现，PM2.5短 期 暴 露 可 诱 导BALB/c小鼠急性呼吸道炎症。

芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）属于碱性螺旋-环-螺旋超家族中的PAS亚家族，是配体依赖的多功能转录因子，参与细胞内外环境变化检测，感知生物节律变化和氧化还原电位，在正常细胞发育和免疫调节中发挥作用［11］。AhR配体（如二噁英、二噁英类化合物、TCDD、PAH和PM）可激活细胞内AhR，AhR解离易位至细胞核，与AhR核转位蛋白（ARNT）形成二聚体转录因子。最近研究发现，AhR可与环境毒物相互作用影响机体免疫应答［12］。因此，本研究假设AhR可能有助于调节PM2.5诱导的炎症中的免疫反应，并在环境因素与炎症性气道疾病间起桥梁作用。

细菌溶解产物（broncho-vaxom，BV）是一种由8种细菌（金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、化脓性链球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、臭氧克雷伯菌、绿色链球菌和肺炎双球菌）组成的细菌溶解物，已被证明可增强免疫应答，对先天性免疫和后天性免疫反应具有多种调节作用［13］。研究发现，BV可在黏膜相关淋巴组织中诱导免疫调节反应，进而抑制Th2诱导的免疫应答，降低过敏原特异性IgE浓度，增加IL-10分泌［14］。同时，BV可有效治疗和预防上呼吸道反复感染、哮喘、COPD、慢性支气管炎、急性鼻窦炎、过敏性鼻炎、过敏性皮炎［15-17］。因此，课题组推测BV可能是预防和治疗PM2.5相关炎症疾病的新方法。为更好地了解PM2.5暴露及BV治疗对小鼠气道炎症的作用及机制，本研究旨在探究正常健康小鼠暴露于城市交通相关PM2.5是否会导致气道炎症，吸入PM2.5是否通过AhR途径参与气道炎症性疾病发病过程，BV可能是否通过调节免疫失衡减轻PM2.5诱导的小鼠气道炎症。

1 材料与方法

1.1 材料SPF级BALB/c雌性小鼠30只，6~8周龄，购自重庆医科大学实验动物中心，饲养于重庆医科大学实验动物中心代养室，21~24℃，50%~60%相对湿度。本研究经重庆医科大学动物保护与伦理委员会批准。ELISA试剂盒（eBioscience，SanDiego，CA）；反转录酶（Invitrogen）；抗AhR（Sigma-15 Aldrich，USA）；抗β-肌动蛋白（Beyotime）。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5收集采用重庆市环境监测中心的Thermo Scientific TEOM1405-D颗粒监测仪收集2018年12月至2019年9月大气PM2.5样品，采样地点为重庆医科大学附属第一医院3号楼楼顶，周边为交通繁忙的十字路口且无大型工业工厂。PM2.5收集于预先称好重量的石英纤维过滤膜，每24 h更换1次过滤膜，换下的石英纤维滤膜在60℃烘箱中干燥6 h后称重。将含有PM2.5的滤膜切成2 cm×1 cm小块，浸入100 ml去离子蒸馏水中，超声振荡2 h，振荡液用12层无菌纱布进行过滤，将滤液进行真空冷冻干燥并称重。无菌生理盐水配制不同浓度PM2.5混悬液，高压灭菌，4℃避光保存备用。

1.2.2 动物实验方案30只小鼠随机分为对照组、PM2.5暴露组和BV干预组，每组10只。第1~15天，对照组气管滴注生理盐水，1次/d，PM2.5暴露组和BV干预组气管滴注PM2.5悬浮液（8 mg/kg），1次/d；第16~90天，对照组和PM2.5暴露组口服给予生理盐水，0.2 ml/（只·d），BV干预组口服给予BV溶液（50 mg/ml），0.2 ml/（只·d）。根据预实验结果和文献，本研究采用暴露式气管滴注法染毒［18-20］。末次干预后24 h内处死小鼠，取血、气管及肺组织保存备用。

1.2.3 HE染色4%多聚甲醛处理小鼠气管组织，石蜡包埋切片（4~5µm），HE染色，光镜下观察组织病理学改变。

1.2.4 ELISA检测血清细胞因子水平小鼠心脏取血，4℃、1 500 r/min离心10 min，取上清，-80℃保存备用。按特异性ELISA试剂盒说明检测血清中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-17和IL-33水平，结果以pg/ml表示。

1.2.5 RT-qPCR检测AhR mRNA表达采用TRIzol提取液提取肺组织样本总RNA，随机六聚体引物和RNase H-反转录酶反转录为cDNA。采用ABI Prism 7500 PCR系统和SYBR Premix-Taq染料进行实时荧光PCR，检测mRNA表达。AhR F：5'-TCCCTTATGAGTGCCTTGA-3'，R：5'-GTCTGATTTCCTCGTGTTTC-3'。PCR反应按以下步骤重复2次：50℃2 min，90℃10 min，95℃15 s，循环50次，60℃1 min。比较Ct法计算mRNA相对表达，以β-actin为内参，无模板样品为阴性对照。

1.2.6 Western blot检测AhR蛋白表达溶解肺组织，提取蛋白，进行Western blot实验，采用抗AhR或抗β-肌动蛋白进行一抗孵育，采用ECL化学发光反应试剂盒测定膜中蛋白免疫反应性，医用胶片中暴露。

1.3 统计学处理采用Medcalc15.2.2软件进行统计学分析，组间比较采用t检验或单因素方差分析（ANOVA）。数据不符合正态分布时采用Mann-Whitney秩和检验，正态分布资料以±s表示，偏态分布资料以“中位数和四分位数间距”表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PM2.5及BV对小鼠气道炎症的影响小鼠气管黏膜HE染色如图1所示，与对照组相比，PM2.5和BV干预组气管黏膜中性粒细胞和淋巴细胞浸润明显增加，且BV干预组炎症细胞浸润轻于PM2.5暴露组，淋巴细胞数明显少于PM2.5暴露组。

图1 各组小鼠气管HE染色（×400）Fig.1 HE staining of trachea of mice in each group（×400）

2.2 PM2.5及BV对小鼠血清细胞因子表达的影响ELISA检测血清中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-17和IL-33水平，如表1所示，PM2.5暴露组小鼠IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-33水平较对照组显著升高（P<0.05），IL-10水平显著降低（P<0.05）；IFN-γ与对照组差异无统计学意义（P=0.134）。BV干预组小鼠IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-33水平较PM2.5组降低（P<0.05）；BV干预组IL-10水平较PM2.5组显著升高（P=0.012），BV干预组IFN-γ水平与PM2.5组差异无统计学意义（P=0.353）。

表1 各组小鼠血清中细胞因子表达（±s，pg/ml）Tab.1 Cytokine expressions in serum of mice in each group（±s，pg/ml）

表1 各组小鼠血清中细胞因子表达（±s，pg/ml）Tab.1 Cytokine expressions in serum of mice in each group（±s，pg/ml）

Note：1）P<0.05 vs control；2）P<0.05 vs PM2.5.

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2.3 PM2.5及BV对小鼠肺组织中AhR表达的影响检测小鼠肺组织AhR mRNA和蛋白表达，PM2.5暴露组AhR mRNA表达（1.861 2±0.086 2）较对照组（1.115 0±0.070 9）显著增加（P<0.001），PM2.5暴露组AhR蛋白表达（0.890 2±0.092 8）较对照组（0.381 5±0.034 9）显著增加（P=0.001）。BV干预组AhR mRNA和蛋白表达均较PM2.5暴露组显著降低（P<0.001，图2）。

图2 各组小鼠肺组织AhR mRNA、蛋白表达Fig.2 Expressions of AhR mRNA and protein in lung tis⁃sue of mice in each group

3 讨论

PM2.5是我国空气污染的主要成分，其表面可吸附各种有毒物质，与多种呼吸系统、循环系统及代谢系统疾病有关。AhR是配体依赖的多功能转录因子，参与细胞内外环境变化检测，最近研究发现，AhR可与环境毒物产生相互作用，影响机体免疫反应［12］。BV目前已被证明可增强免疫反应，对先天性免疫和后天性免疫应答具有多种调节作用［13］。因此，本研究旨在从AhR信号通路激活致Th免疫失衡的角度，探讨PM2.5暴露及BV治疗对小鼠气道炎症的作用及机制。

OGINO等［21］研究提示，PM2.5暴露后小鼠出现相关气道炎症反应和免疫紊乱，主要表现为颗粒物暴露后小鼠IL-4、IL-5和IL-13表达增强，而IL-4、IL-5和IL-13是过敏性气道炎症的重要募集因子，在介导Th1/Th2细胞免疫失衡中起重要作用。同时，Th17和Th2型免疫反应上调在过敏性气道炎症病理生理过程中起重要作用，某些具有酶活性的变应原可诱导上皮细胞产生细胞因子和趋化因子，从而促进Th2反应。随着辅助性T（Th）细胞新亚群（Th17细胞和Treg细胞）的发现，研究证实Th17细胞可调节Th2反应和嗜酸性粒细胞活化等多个靶点，在气道炎症中发挥重要作用。本研究中PM2.5暴露后小鼠出现气道黏膜炎症细胞浸润及Th细胞相关细胞因子失衡，包括Th17相关细胞因子IL-17和Th2相关细胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-33表达增加，提示Th17和Th2细胞介导的免疫平衡在PM2.5诱导的气道炎症中起重要作用。

AhR作为一种配体依赖性转录因子，在树突状细胞（DC）表面高表达，可与环境中及体内某些代谢产物结合，调节DC分化、成熟及功能，调节人体免疫反应。DC细胞是Th细胞网络失衡促发细胞因子分泌失衡的核心“阀门”，是前所知功能最强的抗原提呈细胞（APC），是决定naive T细胞向Th1、Th2、Th17和Treg分化的细胞［22］。因此，AhR在调控细胞免疫平衡中可能发挥重要作用。同时，AhR对环境刺激敏感，已被证明是多环芳香烃、二噁英等环境有机污染物致癌、致畸的重要介导者和传感器。本团队研究表明，过敏性鼻炎中，AhR配体ITE（噻唑-4-羧酸甲酯AhR激动剂）可通过抑制Th17细胞分化及抑制IL-17产生显著降低炎症反应［23］。AhR不仅可介导环境污染物毒性作用，还在炎症、纤维化、肿瘤、免疫调节、生长发育及维持生理稳态等多种病理生理过程中发挥重要作用。AhR信号通路是环境因素诱导机体疾病的关键机制之一，本研究在PM2.5暴露小鼠肺组织中发现AhR mRNA和蛋白表达显著增加且血清中Th细胞相关细胞因子失衡，因此推测AhR在PM2.5暴露和炎症性气道疾病间起桥梁作用，PM2.5可通过激活AhR信号通路诱导气道炎症和介导Th1/Th2和Th17/Treg免疫失衡。

BV目前已用于复发性呼吸道感染、哮喘、COPD、慢性支气管炎、过敏性鼻炎、鼻窦炎等其他呼吸系统疾病治疗，在黏膜相关淋巴组织内诱导免疫调节反应。哮喘小鼠模型中，口服BV有利于调节Th1/Th2平衡，减轻小鼠哮喘模型气道炎症，有效预防支气管哮喘发生发展［24］。此外，口服BV可增加气道黏膜组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg含量，并减弱气道高反应性［25］。本研究发现，给予PM2.5诱导的气道炎症BV干预，IL-17表达显著减少，IL-10表达显著增多，AhR表达显著下调，提示BV可能通过AhR相关通路调节Th细胞间免疫平衡，有望成为PM2.5相关气道炎症性疾病治疗的新靶点。

综上所述，城市交通相关PM2.5可诱导正常健康小鼠气道炎症及血清中Th相关细胞因子失衡，且PM2.5可能通过AhR信号通路参与气道炎症发生发展，而BV可通过AhR信号通路调节免疫反应减轻PM2.5诱导的气道炎症，为PM2.5相关气道炎症疾病治疗提供新靶点。