广枣总黄酮对三氧化二砷诱导心肌细胞损伤的作用

杨秀华 智 慧 艾 丹 肖云峰

1.呼伦贝尔职业技术学院蒙医蒙药系，内蒙古呼伦贝尔 021000；2.内蒙古医科大学药学院，内蒙古呼和浩特 010110

三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）俗称砒霜，是最古老的毒药之一，外用杀虫去腐，内服截痰平喘，攻毒抑癌[1]，也被用于治疗结核、银屑病、梅毒等疾病[2]，现用于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）的治疗[3-4]，对乳腺癌[5-6]、肝癌[7-9]、胃癌[10]等恶性肿瘤也可发挥较好的效果，应用前景良好[11-12]。但是，ATO 属于剧毒药物，在治疗肿瘤的过程中所引起的心脏毒性，限制其在临床上的广泛应用。长期使用可致Q-T 间期延长[13]、尖端扭转型室速[14]、甚至心源性猝死[15-17]。因此，如何减少ATO 在应用过程中产生的心脏毒性，是现代药理学研究的重点内容之一。广枣是漆树科植物南酸枣的成熟果实，为蒙医常用药材，在治疗心血管疾病的药方中，半数以上是以广枣为主药或是配伍有广枣[18]。广枣总黄酮（total flavnoids of fructus choerospondiatis，TFFC）是广枣治疗心血管系统疾病的主要活性成分，具有抗心律失常[19-20]、增强免疫力[21]、改善心肌缺血[22-23]等作用，可以清除心肌缺血时产生的大量氧自由基[24-25]，保护心肌免受严重损伤。本研究深入的探讨蒙药广枣对ATO 诱导心肌损伤的作用，为TFFC 减轻ATO 产生的心肌损伤提供重要的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

CCK-8 试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，13H30C60）；Hoechst 染色试剂（上海碧云天公司，051618180905）；倒置生物显微镜（德国Leica 公司，DM3000）；CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；全自动生化分析仪（爱尔兰apphire 公司，Multiskan MK3）；流式细胞仪（美国Merck 公司，guava easyCyte）；健康清洁级Wistar 乳鼠25 只（雌雄不限，1～3 d，5～9 g）购自内蒙古医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证编号：SCXK（蒙）2015-0001，饲养于内蒙古医科大学动物实验中心（温度20～26℃，湿度40%～70%），动物饮水为无菌水，每天定时喂食，每隔2 d 更换1次垫料。所有动物实验经过内蒙古医科大学动物管理协会批准进行，符合内蒙古医科大学伦理委员会动物实验相关要求。

1.2 原代乳鼠心肌细胞的培养与分离

在无菌条件下取新生Wistar 乳鼠的心尖组织，置PBS 液清洗，移至0.1%胰酶中，剪碎，加入6 ml 0.1%胰酶消化6 min，静置后弃上清。再加入5 ml 混酶，消化5 min，静置后吸上清转移至玻璃瓶中，加入5 ml 10%FBS 的培养基终止消化，重复10 次。1000 r/min（r=13.5 cm）离心10 min，弃上清，用20%FBS 的培养基重悬，置培养箱内培养60 min，转移至新培养瓶，继续培养48 h 后进行后续实验[26]。

1.3 心肌细胞形态学观察

在倒置显微镜下观察培养0、12、24、48、72 h 以及7 d 的心肌细胞的生长情况与细胞的形态。

1.4 细胞分组及处理

实验设置空白组、模型组（ATO 6 μg/ml）、TFFC高浓度组（TFFC 100 μg/ml+ATO 6 μg/ml）、TFFC 中浓度组（TFFC 50 μg/ml+ATO 6 μg/ml）、TFFC 低浓度组（TFFC 25 μg/ml+ATO 6 μg/ml）。空白组加入无血清DMEM/F12 培养基培养12 h 后换用无血清DMEM/F12 培养基培养12 h；模型组加入无血清DMEM/F12 培养基培养12 h 后换用终浓度为6 μg/ml ATO 培养基培养12 h；TFFC 低、中、高浓度组分别加入终浓度为25、50 μg/ml 和100 μg/ml TFFC 培养基培养12 h 后换用终浓度为6 μg/ml ATO 培养基培养12 h。

1.5 CCK-8 法检测细胞存活率

按“1.4”分组处理后，每孔加入10 μl CCK-8 试剂，培养1 h，于酶标仪450 nm 处测量吸收度值，计算存活率，实验重复6 次，取平均值。

1.6 各心肌酶及抗氧化酶检测

培养液中谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、磷酸肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）活力的检测：按“1.4”分组处理后，采用全自动生化分析仪检测，重复6 次，取平均值。

细胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力的检测：按“1.4”分组处理后，严格按照试剂盒说明书进行检测，重复6 次，取平均值。

1.7 细胞凋亡的测定

1.7.1 Hoechst 33342 染色观察心肌细胞凋亡水平按“1.4”分组处理后，弃培养液。加入Hoechst 33342染液250 μl，避光孵育30 min，使用荧光显微镜观察细胞凋亡情况。

1.7.2 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒检测心肌细胞凋亡率 按“1.4”分组处理后，用0.25%胰酶消化收集细胞，后续操作严格按照说明书进行，用流式细胞仪在1 h 内检测细胞凋亡率，实验重复3 次，取平均值。

1.8 统计学方法

采用Graphpad Prism8.0 软件和SPSS 22.0 软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组比较采用方差分析，两组比较采用独立样本t检验。计数资料以例数表示。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞形态学观察

刚分离纯化的细胞多为圆形，见图1A；培养12 h细胞已部分贴壁，多数仍为圆形，见图1B；培养24 h细胞大部分已贴壁，多数呈梭形、圆形，少数细胞有自发性搏动，见图1C；培养48 h 细胞基本都贴壁，大多数细胞伸出伪足伴有自发性搏动，见图1D，此时的细胞可用于后续实验；培养72 h 细胞形成细胞簇，成放射状排列，且同步搏动，见图1E；培养5～7 d 的细胞形成细胞层，搏动快而强且同步化，见图1F。

图1 倒置显微镜下心肌细胞的形态（100×）

2.2 CCK-8 法检测心肌细胞活力

与空白组比较，模型组细胞存活率显著下降，差异有高度统计学意义（P ＜0.05）。与模型组比较，TFFC 各浓度组细胞存活率显著升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.05）。TFFC 中、高浓度组细胞存活率高于TFFC 低浓度组，且TFFC 高浓度组高于TFFC中浓度组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

图2 TFFC 对ATO 诱导心肌损伤的保护作用（n=6）

2.3 TFFC 对心肌酶和抗氧化酶活力检测结果的影响

与空白组比较，模型组细胞培养液中GOT、CK 和LDH 的活力显著升高，心肌细胞中SOD、GSH-Px、CAT 活力显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与模型组比较，TFFC 各浓度组细胞培养液中GOT、CK和LDH 的活力均显著降低，心肌细胞中SOD、GSH-Px、CAT 活力显著升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1～2。

表1 各组心肌细胞培养液中GOT、CK、LDH 比较（U/L，，n=6）

表1 各组心肌细胞培养液中GOT、CK、LDH 比较（U/L，，n=6）

注：与空白组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。TFFC：广枣总黄酮；GOT：谷草转氨酶；CK：磷酸肌酸激酶；LDH：乳酸脱氢酶

表2 各组细胞中SOD、GSH-Px、CAT 比较（，n=6）

表2 各组细胞中SOD、GSH-Px、CAT 比较（，n=6）

注：与空白组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。TFFC：广枣总黄酮；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶；CAT：过氧化氢酶

2.4 Hoechst 33342 染色观察心肌细胞凋亡形态

空白组心肌细胞呈均一核染，呈现均匀的低强度荧光，且未见核异常，见图3A；模型组细胞呈亮蓝色，凋亡细胞数目增多，见图3B；TFFC 低、中、高浓度组蓝色荧光强度明显减弱，见3C～E。

图3 Hoechst 染色观察心肌细胞凋亡形态（100×）

2.5 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒检测心肌细胞凋亡率

空白组仅有少部分细胞发生凋亡，见图4A；模型组凋亡细胞数目明显增加，见图4B；TFFC 各浓度组细胞的凋亡情况均不同程度得到改善。见图4C～E。与空白组比较，模型组细胞凋亡率显著增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与模型组比较，TFFC 各浓度组细胞凋亡率均显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。TFFC 中、高浓度组细胞存活率低于TFFC 低浓度组，且TFFC 高浓度组低于TFFC 中浓度组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图5。

图4 流式细胞图

3 讨论

本研究在传统的原代心肌细胞培养基础上进行改良优化，从鼠龄、消化酶的种类、浓度、时间、程度及差速贴壁时间等多个方面进行考察，成功构建了良好的乳鼠原代心肌细胞的模型。利用6 μg/ml ATO 建立体外心肌氧化损伤模型，CCK-8 检测结果显示，ATO可显著降低心肌细胞的活力，而TFFC 各浓度组均可明显增加ATO 诱导状态下心肌细胞的活力。

评定心肌受损的重要标志之一是心肌酶表达水平的变化，临床上常以LDH、CK、GOT 活力升高作为判断心肌受损的诊断指标[27]。正常生理状态下，心肌细胞培养液中LDH、CK、GOT 的活力较低，而当心肌细胞膜受损时，心肌酶漏出量将显著增加。研究结果显示，TFFC 低、中、高浓度组均能够显著降低ATO 诱导的细胞培养液中LDH、CK 和GOT 活力，提示TFFC能够抑制受损细胞的LDH、CK、GOT 漏出，维护细胞膜的完整性，改善心肌的受损程度。CAT、GSH-Px 和SOD 是体内重要的抗氧化酶，是评估机体抗氧化防御体系功能的重要指标。CAT 可将过氧化氢分解为水和氧气，清除体内的过氧化氢，防止过量的过氧化氢对机体造成的损伤。GSH-Px 通过维持机体氧化与抗氧化平衡，而使细胞膜免受过氧化物的损伤。SOD 是重要的自由基清除剂，广泛存在于生物体的各组织中，可对抗和修复氧自由基对心肌组织所造成的损伤[28-29]，本实验结果显示，TFFC 各浓度组心肌细胞中CAT、GSH-Px 和SOD 活力较ATO 模型组显著升高，提示ATO 抑制内在的保护性抗氧化能力来诱导心肌细胞的氧化应激，TFFC 具有较好的抗氧化作用，有利于减轻由ATO 诱导的心肌损伤。

心肌细胞凋亡是导致心肌损伤的重要发病机制之一。Hoechst 33342 荧光染色可以直观观察心肌细胞的凋亡状态，AV/PI 双染流式检测实验可以用来区分细胞的不同存活状态，定量检测心肌细胞的凋亡率。通过Hoechst 33342 荧光染色可知，模型组细胞呈亮蓝色，提示凋亡细胞数目较多，而TFFC 各浓度组蓝色荧光强度明显减弱，提示TFFC 可以改善心肌细胞凋亡状态。流式细胞仪检测细胞凋亡率可知，模型组凋亡细胞及坏死细胞数目较多，而TFFC 各浓度组可以显著降低凋亡率，对ATO 损伤的心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用，课题组下一步将展开TFFC 调控具体凋亡基因的研究。

本研究认为TFFC 对ATO 诱导的心肌细胞损伤具有显著的保护作用。提示TFFC 与ATO 的组合可能有益于防止ATO 诱导的心脏毒性，TFFC 在心血管疾病的治疗中能够发挥重要作用。