脊椎蛋白2 在胃癌中的表达及临床意义

黄 滨 王丽萍 林振孟

1.解放军联勤保障部队第九〇〇医院麻醉科，福建福州 350025；2.福建省肿瘤医院胃肠肿瘤外科，福建福州 350014

脊椎蛋白2（spondin2，SPON2）是分泌型细胞外基质蛋白，属于Mindin/F-pondin 家族的成员[1]。SPON2参与多种重要的细胞活动功能，比如促进神经元生长和发育[2-3]。先前研究发现在原发性肝癌、肾癌中SPON2 表达上升，并作为预后不良的重要指标[4-6]。本研究探讨SPON2 与胃癌间的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞系、标本

胃癌细胞株BGC-823、MGC-803、SGC-7901 和正常胃黏膜细胞GES-1 购自上海中科院细胞库。选取2013 年1 月至2015 年9 月联勤保障部队第九〇〇医院（以下简称“我院”）病理科存档的120 例胃癌及相应癌旁组织蜡块。纳入标准：①腺癌；②根治性手术；③临床病理资料完整。排除标准：①术前新辅助化疗；②急诊手术。收集2019 年5 月至2020 年9月我院70 例胃癌患者、60 例慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）患者，60 例健康体检者血清，采用酶联免疫吸附试验检测SPON2 的表达水平，电化学发光法检测癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）及糖类抗原19-9（carbohydrate antigen19-9，Ca19-9）。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗人SPON2 抗体购自广州碧云天公司（批号：ab224645）。ELISA 仪器购自西门子（型号：ADVIA CENTAUR）。

1.3 研究方法

1.3.1 细胞培养DMEM 进行细胞培养，在5%CO2、37℃的培养箱进行传代。

1.3.2 Western blot 检测 培养细胞48 h，提取蛋白，电泳，转膜，加入一抗（稀释比例1:1000）过夜，加入二抗，显影。

1.3.3 免疫组化 石蜡组织标本切片，修复抗原，封闭蛋白，加入一抗（稀释比例1:1000）孵育过夜，加二抗，显色，复染，封片。SPON2 主要定位于细胞浆。根据细胞染色强度和阳性细胞比例进行分析。染色强度评分：不着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。阳性细胞百分比：阳性细胞百分比＜10%为0 分，10%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，＞75%为4 分。两者相乘，0～3 分为阴性表达，≥4 分为阳性表达[7]。

1.3.4 酶联免疫吸附试验 抽取空腹静脉血5 ml，离心，酶标仪（450 nm 波长）检测吸光度值并绘制标准曲线，通过标准曲线计算SPON2 浓度。

1.3.5 电化学发光法 抽取空腹静脉血5 ml，按照CEA、Ca19-9 试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计学软件数据进行分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验；计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier 法。COX 回归模型行单因素分析和多因素分析；多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t 检验。受试者工作特征曲线（ROC）计算曲线下面积（area under curve，AUC）评价诊断价值，MedCalc 软件比较AUC 的差异。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌细胞及正常胃黏膜细胞中SPON2 的表达量比较

胃癌细胞株SPON2 的表达量均高于正常胃黏膜细胞GES-1（P ＜0.05），见图1、表1。

图1 胃癌细胞及正常胃黏膜细胞中SPON2 蛋白表达

表1 胃癌及正常胃黏膜细胞中SPON2 蛋白的表达量比较（，n=3）

表1 胃癌及正常胃黏膜细胞中SPON2 蛋白的表达量比较（，n=3）

注：与正常胃黏膜细胞比较，aP ＜0.05。SPON2：脊椎蛋白2

2.2 SPON2 在胃癌及癌旁组织中的表达情况比较

SPON2 在胃癌组织中阳性率为48.3%（58/120），高于癌旁正常组织的17.5%（21/120）（χ2=25.832，P ＜0.01），见图2。胃癌组织中不同病理分期、不同浸润深度及淋巴结转移与否的SPON2 表达比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表2。SPON2 阳性的5 年生存率为40.3%，低于阴性患者的60.9%（P ＜0.05），见图3。单因素分析显示SPON2 与患者预后有关（P ＜0.05）。多因素分析显示，SPON2 是胃癌预后的影响因素（P ＜0.05），见表3。

图3 脊髓蛋白2表达阳性和阴性的生存曲线

表2 胃癌组织中SPON2 的表达与临床病理特征关系

表3 临床病例特征与预后的关系

图2 SPON2 在胃癌及癌旁正常组织表达（SP，400×）

2.3 胃癌、CAG 和健康体检者血清中SPON2、CEA、CA19-9 的表达比较

胃癌、CAG 和健康体检者年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病和体重指数比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见表4。胃癌患者血清SPON2、CEA、CA19-9 浓度均高于CAG、健康体检者（P ＜0.05），见表5。

表4 胃癌、CAG 和健康体检者一般资料比较

表5 胃癌、CAG 和健康体检者血清中SPON2、CEA、Ca19-9 的表达量比较

2.4 SPON2、CEA、CA19-9 及三者联合检测对胃癌的诊断价值

血清SPON2、CEA、Ca19-9 三者联合检测AUC与单独检测比较，差异有统计学意义（Z=3.012、3.121、3.119，均P ＜0.05），见表6、图4。

图4 SPON2、CEA、Ca19-9 及三者联合检测诊断胃癌的ROC 曲线

表6 血清各指标对胃癌的诊断价值

3 讨论

胃癌是世界第五大常见恶性肿瘤，60%～70%患者发现时处于中晚期[8-11]。检测血液的肿瘤标志物具有简便、经济的特点，是早期诊断和评估癌症复发风险的理想方法[12-14]。CEA、Ca19-9 是广泛用于胃癌早期诊断、评价预后和术后复查的生物标志物。然而，对胃癌早期诊断的敏感性及特异度均较差[15-16]。因此，寻找新的生物标志物提高胃癌的诊断具有至关重要的作用。

SPON2 是由331 个氨基酸残基（36 kD）组成的保守分泌型细胞外基质蛋白，在多种肿瘤中高表达[17-19]。血清SPON2 水平升高可作为前列腺癌和肺癌的标志物[20-21]。SPON2 在喉癌组织中表达明显高于癌旁组织，通过PI3K/AKT 信号通路促进喉癌细胞增殖和侵袭[22]。SPON2 与结直肠癌患者的病理分期、浸润深度、Dukes 分期显著相关，表达阳性预示患者预后不良[23-24]。胃癌细胞中SPON2 基因的表达下调可显著抑制细胞的增殖、迁移和侵袭[25-26]。

本研究中，胃癌细胞株中SPON2 含量均高于正常胃黏膜细胞，在胃癌石蜡标本中SPON2 阳性率高于癌旁正常组织，胃癌血清中SPON2 含量高于CAG 及健康体检者，提示SPON2 在胃癌的发生中起重要作用，可作为靶向治疗的潜在靶点。胃癌组织中，SPON2 阳性患者5 年生存率低于阴性患者，因此，对于SPON2阳性患者术后需要采取更积极的辅助治疗及复查。本研究中SPON2 与淋巴结转移、浸润深度、病理分期有关，提示SPON2 与胃癌的进展有关。ROC 曲线分析显示术前血清SPON2 对胃癌的预测效果良好，与CEA、Ca19-9 相结合，更有利于胃癌的早期诊断。

总之，本研究提示胃癌细胞、组织、血清中SPON2蛋白的表达上调，SPON2 参与胃癌的发生及发展，可能是胃癌诊断、判断预后的新指标，可作为胃癌治疗新的靶点。