添加剂对氨基酸多晶型溶液结晶过程影响的研究进展

苏伟怡，刘星，郝琪，郭攀，郝红勋，李春利

（1河北工业大学化工学院，化工节能过程集成与资源利用国家地方联合工程实验室，天津 300130；2天津大学化工学院，天津 300072）

药物多晶型是指同一物质具有两种或两种以上空间排列形式[1-2]。同一药物不同晶型在溶解度、溶出速率等方面的差异会直接影响药物疗效。所以，药物多晶型质量控制对保证药品的稳定性、安全性和有效性具有重要意义[3-5]。多晶型溶液结晶过程受很多因素的影响[6-11]，Kitamura[12-13]根据作用效果将其分为两大类：主要因素包括过饱和度、温度、搅拌速率、反应物的混合速度和晶种的加入；次要因素包括溶剂、添加剂、界面和pH等。

氨基酸是构成多肽和蛋白质的基础物质，对生命的健康和生理平衡具有重要意义[14-15]，且普遍存在多晶型现象。其中，甘氨酸在水溶液中直接结晶可得到介稳α晶型[16]，不易得到β和γ晶型。L-组氨酸纯水溶液冷却结晶仅可得到晶型A和B的混晶[17]。而L-谷氨酸的β晶型呈薄片状，离心时易断，过滤时易阻塞，所以工业上更倾向于得到流动性更强的介稳α晶型，但在水溶液中β晶型极易在α晶型表面成核，从而加快α晶型向β晶型的转化，因此不易得到纯净α晶型[18-19]。越来越多的研究发现，合适的添加剂能有效调控多晶型结晶[10]，比如NaCl能促进甘氨酸γ晶型的成核[16]；溶液中加入甲醇、乙醇等有机溶剂能得到甘氨酸的β晶型[8]。因此，本文主要以上述三种氨基酸的溶液结晶过程为例，对不同添加剂的作用方式及机理进行综述，以期为该类产品的生产控制提供参考。

1 电解质添加剂

电解质是以离子键或极性共价键结合的物质，溶于水中或在熔融状态下能够解离成自由移动的离子。氨基酸中有酸性中心和碱性中心，易受带电基团或离子的影响，通常加入电解质后，能改变氨基酸带电离子之间的连接方式，从而改变氨基酸的成核和生长过程。这里分别讨论了无机酸和碱、无机盐作添加剂对氨基酸不同晶型成核和生长的影响，最后从电荷补偿的角度解释了电解质影响成核和生长的机理。

1.1 无机酸和碱

在纯水溶液中，氨基酸两性离子以特定的方式结合、聚集，但加入酸或碱后，两性离子变成氨基酸的阳离子或阴离子，因此之前的聚集体被破坏，从而可能对各晶型的成核和生长过程造成不同影响，下面将从成核和生长两方面进行分析。

从影响成核的角度，无机酸或碱的加入可以影响溶液的pH，这对氨基酸类物质的成核有直接的影响。如Towler等[21]发现，在甘氨酸的溶液结晶中，当pH接近甘氨酸的等电点（pI=5.97）时得到α晶型；当加入酸或碱（氨、硫酸或乙酸）后，pH高于8.9或者低于3.8时能够得到γ晶型。Han等[20]发现，溶液中酸碱（HCl、HNO3、NaOH、KOH）浓度很低时，α晶型因成核速率稍有增加而成为优势产品；但是，当酸碱的摩尔浓度大于0.5mol/kg时，γ晶型成核的介稳区宽度变窄，因此只得到γ晶型。在水溶液中，甘氨酸分子中的羧基将质子转移到氨基上形成甘氨酸两性离子，这些两性离子相互作用形成的环状二聚体[图1(a)]与α晶型内分子排列方式相似，因此更易形成α晶型。而加入酸或碱后，分别形成了甘氨酸阳离子（+H3NCH2COOH）和甘氨酸阴离子（H2NCH2COO-），这些离子可与溶液中的甘氨酸两性离子结合形成与甘氨酸γ晶型结构类似的头尾连接的开口二聚体[图1(b)]，从而可以促进γ晶型的成核。

图1 甘氨酸二聚体

图2 甘氨酸晶体简单结构

1.2 无机盐

无机盐由阴离子和阳离子构成，其对氨基酸多晶型溶液结晶过程的影响方式与酸碱相似，但是不同的是无机盐阴阳离子的价态、组成都会对成核、生长及转晶过程有不同的影响。

Han等[30]研 究 了 不 同 无 机 盐[NaCl、KNO3、(NH4)2SO4、MgSO4、Ca(NO3)2]对甘氨酸α晶型向γ晶型转变过程的影响，发现大部分盐可大大缩短α晶型向γ晶型转变的时间，但是因为盐种类的不同，其影响程度又有所不同。Han等[31]通过测量甘氨酸α晶型和γ晶型单晶的生长速率，研究了一价阳离子 盐[NaCl、Na2CO3、Na2SO4、KCl、KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4]和 二 价 阳 离 子 盐[MgSO4、Ca(NO3)2、Mg(NO3)2]对两种晶型生长的影响，发现一价阳离子盐能抑制两种晶型c轴方向的生长，但同时又促进两种晶型b轴方向的生长。而三种二价阳离子盐都明显地抑制了γ晶型的生长，但是对α晶型b轴方向生长的影响并不明显，因此二价阳离子盐存在时均得到α晶型。

Duff等[32]计算了NaCl对甘氨酸α晶型和γ晶型结晶过程界面能的影响，发现当NaCl浓度为80mg/mL时，γ-甘氨酸界面能降低7.7mJ/m2，而α晶核界面能则增大3.1mJ/m2。这进一步验证了NaCl对γ晶型结晶的促进作用。由此可见，通过溶液中的分子模拟和计算可以解释或者预判添加剂对氨基酸多晶型成核、生长的影响。这也成为添加剂分子设计及筛选的有效方式之一。

无论是无机酸、碱还是无机盐，都是通过电荷的作用影响氨基酸的成核或生长。2013年，Renuka Devi等[33]首次通过电荷补偿机制揭示了水溶液中α-甘氨酸和γ-甘氨酸的成核行为。电荷补偿方式可分为两种类型：一种类型是甘氨酸两性离子通过自电荷补偿构成环状二聚体，有利于α晶型的成核；另一种类型是两性离子通过侧向氢键堆叠形成链状结构，有利于γ晶型成核，但是只在诱导电荷补偿剂（induced charge compensators，ICC）存在的条件下发生。ICC存在时，甘氨酸电荷补偿类型从自电荷补偿转变为诱导电荷补偿。比如当乙酸钠（CH3COONa）[34]、硝酸铵（NH4NO3）或氢氧化钠（NaOH）[34]存在并且超过临界浓度时，甘氨酸两性离子的自电荷补偿被抑制，最终形成γ多晶型。在乙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和L-苹果酸等诱导电荷补偿剂存在时，缓慢蒸发水溶液同样可以获得γ-甘氨酸[35]。Renuka Devi等[36]也已证明在丙二酸存在且超过临界浓度时，甘氨酸团簇整体呈阳离子化，因此最终得到纯的γ晶型。所以在一定程度上，从电荷补偿的角度可以统一解释无机酸、碱、盐对甘氨酸成核和生长的影响。

2 tailor-made添加剂

1997年，Liu[37]提出了设计定制（tailor-made）添加剂的概念，这些添加剂结构通常类似于宿主分子，因此可以影响晶体成核及生长过程。为控制多晶型而设计的tailor-made添加剂可分为两类：抑制剂和促进剂[38]。Dowling等[39]提到的立体定向抑制剂就是一种tailor-made抑制剂，它由两个部分组成：结合剂，用于黏附在晶体的表面；干扰剂，用于抑制分子的沉积。tailor-made添加剂用于产生特定的晶型或抑制不良晶型的生长已被证明是非常成功的策略，在晶体形态工程和多晶型控制领域有重要应用[40-41]。

2.1 tailor-made添加剂对结晶过程的影响

tailor-made添加剂具有与宿主分子相似的结构，当宿主分子形成晶核时，这些添加剂可能掺入宿主分子中，或者掺杂进已经形成的晶核内，影响成核。Dhanasekaran等研究了缓慢蒸发结晶过程中L-苯丙氨酸[42]和L-酪氨酸[43]对L-谷氨酸多晶型成核的影响。发现与纯水溶液中仅得到β晶型不同，当添加剂L-苯丙氨酸的浓度在0.03～0.07g/100mL、L-酪氨酸的浓度在0.01～0.07g/100mL范围内时，仅出现α晶型；L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的浓度超过0.07g/100mL时，溶液中的成核被完全抑制，α晶型和β晶型晶体均未出现。一般认为这两种添加剂的影响机理如图3所示，当溶液中没有其他分子时，溶质分子可在过饱和溶液中形成(α)n和(β)n两种晶核，最终稳定的β晶型在系统中占主导；但如果在适当的时间向溶液中添加可抑制β晶型成核的添加剂，它将选择性地掺杂到β晶核中，阻碍(β)n的形成，最终则会得到亚稳态α晶型[44]。更高浓度的添加剂阻止成核的原因可能是添加剂分子完全阻止宿主分子的聚集，(α)n和(β)n晶核均难以形成。与此类似，随着添加剂L-苯丙氨酸和L-蛋氨酸浓度的增加，甘氨酸α晶型和β晶型的成核被抑制，最终可得到γ晶型[24]；DL-蛋氨酸冷却结晶时，得到α晶型和β晶型的混合晶型，当加入一定量的DL-亮氨酸后，得到纯净的α晶型[45]；在γ-氨基丁酸的冷却结晶中，不存在添加剂时得到的晶体为晶型Ⅰ，当加入一定的乙酸钠、苯甲酸钠、庚酸钠、环己甲酸钠则能得到纯净的晶型Ⅱ[46]。

图3 添加剂控制L-谷氨酸多晶型的原理[45]

晶体不同晶面裸露不同的基团，tailor-made添加剂分子可能选择性地吸附在晶体的某一表面上，阻止溶质分子在此晶面的堆积，从而导致晶体的形貌发生变化。Kitamura等[47]研究了L-苯丙氨酸对L-谷氨酸α晶型和β晶型生长动力学的影响，发现在纯水溶液中，对于β晶型，不易观察到β晶体(001)和(010)晶面的生长，而(101)面的生长速率则与时间呈指数关系，如图4(a)所示。加入L-苯丙氨酸后，β晶型(101)面的生长速率减小，与时间的关系变为线性；L-苯丙氨酸浓度超过3.9×10-4mol/L时，生长速率变得不规则，(101)面甚至可能分叉，见图4(b)；当L-苯丙氨酸的浓度增加到7.7×10-4mol/L时，生长停止。而对于α-L-谷氨酸，其结构如图4(c)所示，在水溶液中A1、A2、A3和D1方向生长速率与时间呈线性关系；当L-苯丙氨酸浓度超过5.2×10-3mol/L时，D方向上的生长速率没有明显变化，但A方向上的生长速率显著降低，最终(011)面消失，出现新的(110)面，如图4(d)所示。同样的晶体形态变化Cashell等[19]也提到过。

图4 L-谷氨酸晶体结构[47]

Kitamura进一步分析了α-L-谷氨酸的晶面特征，指出(001)表面裸露羧酸基团，其与L-苯丙氨酸相互排斥，因此该晶面的生长不受影响；但是(110)、(111)和(011)面上却可以吸附L-苯丙氨酸从而使生长被抑制。此外，Yani等[48]通过计算不同添加剂分子在晶体表面的均方位移，指出添加剂的分子在晶体表面的流动性是影响生长过程的关键参数。如Yang等[49-50]计算了L-缬氨酸分子在L-丙氨酸(011)面和(120)面的吸附能，发现其与(011)表面结合能较小，添加剂分子流动性较好，因此对(011)面的生长没有明显影响；但其在(120)表面上可强烈吸附，流动性较差，因此可通过排斥L-丙氨酸分子扰乱晶体的规则排列，从而强烈抑制(120)面的生长，最终使L-丙氨酸晶体形貌发生明显的变化。与此相似，Torbeev等[24]发现在甘氨酸多晶型的溶液结晶过程中，当水溶液中存在较高质量分数的丝氨酸、赖氨酸、组氨酸和谷氨酸时，最终得到的α晶型与纯水溶液中得到的α晶型形貌有明显的差别；DL-蛋氨酸α晶体在DL-亮氨酸存在时，b轴和c轴方向的生长被抑制，只有a轴方向延长，形貌发生明显改变[45]。

综上所述，因为不同晶面裸露的官能团可能不同，tailor-made添加剂分子在晶面上的吸附作用明显不同。吸附能较大的面生长被抑制，吸附能小的面生长速率变化较小，最终晶体形貌可能发生明显变化。由于添加剂分子和溶质分子的作用，不同晶型的成核和生长过程也可能受到不同的影响。

2.2 添加剂结构的影响规律

tailor-made添加剂的设计通常参考宿主分子，而分子结构或官能团的微小变化可能对多晶型结晶及转化过程产生不同的影响。

Davey等[55]首次利用分子构象选择添加剂，发现与L-谷氨酸β晶型晶体中分子构象更相似的二甲基戊二酸能抑制β晶型的二次成核，因此最终得到了亚稳的α-L-谷氨酸。Cashell等[56]研究了多种氨基酸添加剂对L-谷氨酸α晶型向β晶型转变速率的影响，发现大部分氨基酸可抑制该转晶过程，但结构不同的氨基酸作用效果不同，按抑制效果由强到弱排列，大致如图5所示。由于L-酪氨酸具有较大的酚基，L-苯丙氨酸中的苯基也较大，所以两者较其他氨基酸对转晶的抑制作用更明显，且由于前者比后者多一个羟基，作用更强。而L-赖氨酸和L-精氨酸结构相似，在浓度1×10-2mol/L及以上时作用效果相似。L-天冬氨酸有两个羧基，且它更类似于L-谷氨酸的分子结构，容易吸附在L-谷氨酸晶体表面上，因此抑制作用相对较强。L-丝氨酸的结构比以上氨基酸添加剂的结构简单，所以即使在浓度达到5×10-2mol/L时，也只能稳定部分α晶型。虽然L-半胱氨酸比L-丝氨酸少一个羟基，但是多出一个巯基，抑制效果比L-丝氨酸好。但是任何浓度的L-蛋氨酸都不能稳定L-谷氨酸的α晶型晶体。

图5 不同结构氨基酸添加剂抑制L-谷氨酸转晶效果排序（①～⑧为由强到弱）

在此基础上，Mo等[57]使用其他氨基酸调控L-谷氨酸的α晶型向β晶型的转化过程，同样发现这些添加剂能阻止α晶型向β晶型的转变，抑制能力强弱的顺序为：L-色氨酸>L-组氨酸>L-苏氨酸>L-缬氨酸>L-亮氨酸>L-丙氨酸。作用效果同样与其分子结构复杂程度一致。

从Davey等[55]、Cashell等[56]、Mo等[57]及Dowling等[39]的研究可知，不同结构添加剂分子对转晶过程的影响因结构的不同而不同。与晶体分子结构越相似，阻碍作用越明显；添加剂结构越复杂，对转晶的抑制作用越强。因此可推测tailor-made添加剂可通过结合剂（羧基、氨基）吸附到晶体表面，同时干扰剂（苯基、酚基、甲基等）占据晶体表面较大的空间，可阻碍宿主分子在晶体表面的堆积，从而阻碍新晶型的形成，表现为对转晶过程的抑制。Kelleher等[58]使用5-氨基间苯二甲酸、5-氨基间苯二甲酸三聚体、5-氨基间苯二甲酸四聚体和5-氨基间苯二甲酸五聚体作为L-谷氨酸结晶的添加剂，结果表明，以上添加剂均可抑制β晶型，从而最终可得到α晶型，但是聚合物的效率要比单体高100～1000倍，进一步证明具有复杂分子结构的添加剂对转晶的抑制作用更强。

但是与以上氨基酸添加剂的作用不同， L-甘氨酸作为最小的氨基酸分子，却可以促进 L-谷氨酸β-晶型的成核，并且能加快α晶型向β晶型的转化[59]。此外，Dowling等[39]发现甘氨酸的浓度越高，β晶型的成核和生长速率就越高，且谷氨酸β晶型在α晶型表面的二次成核越容易，因此可能导致转晶越快。该影响可能与甘氨酸的结构最简单有关。

综上所述，结构简单的甘氨酸能促进L-谷氨酸转晶，得到稳定晶型；结构复杂的氨基酸添加剂能够抑制L-谷氨酸转晶，且结构越复杂对转晶的阻碍作用越明显。羧酸盐添加剂的官能团数量及R基团的亲疏水性对其诱导γ-氨基丁酸晶型Ⅱ成核能力有明显的影响，所以在设计用于控制氨基酸多晶型结晶过程的添加剂分子时，官能团的结构及R基团的亲疏水性应该是重点考虑的内容。

3 混合溶剂对氨基酸多晶型结晶过程的影响

通过改变或混合不同溶剂，可促进或抑制某些晶型的形成，其作用机理与添加剂有一定相似之处[44]。此外，溶析结晶具有操作简单、能耗相对较低、适用于热敏性物质的优势，已广泛应用于工业过程[60]。由于氨基酸大多易溶于水，不易溶于有机溶剂，因此常采用有机溶剂作溶析剂控制不同晶型的产生。如Punmalee等[61]发现，L-组氨酸在二元溶剂混合物中的溶解度顺序为：（水-乙腈）>（水-丙酮）>（水-甲醇）。这表明与乙腈和丙酮相比，甲醇是L-组氨酸的最佳溶析剂。同时发现在溶析剂体积分数较低时，可得到L-组氨酸A和B晶型的混合物；而高溶析剂体积分数则可得到纯净的B晶型。Roelands等[62]通过控制溶析剂乙醇的用量控制溶液的过饱和度，发现当过饱和度比SA≤2.0时，可得到A晶型和B晶型的混晶；而当SA≥2.3时，可获得纯净的B晶型。

Weissbuch等[8]的研究表明，在甘氨酸水溶液中，直接结晶可得到α晶型，而当加入甲醇或者乙醇后，β晶型则率先从溶液中析出。β晶型由单个分子通过氢键连接而成，而非环状二聚体。甲醇或者乙醇的加入使得甘氨酸的溶解度降低，导致溶剂化甘氨酸分子单体浓度相对于氢键连接的环状二聚体浓度增加，所以一定程度上促进了β晶型成核。从生长动力学的角度，一方面，溶剂化甘氨酸分子可通过N—H结合到极性晶面，类似Towler等[21]提出的self-poison理论，而β晶型只有一个小极性面，所以甘氨酸分子对其生长的抑制作用较弱，因此最终得到的晶体主要为β晶型。另一方面，当溶剂化甘氨酸分子结合到α晶型的极性表面，可阻止环状二聚体在该表面的堆积，表现为抑制其生长，而非极性表面则继续生长，这将导致在水-醇溶液中得到的α晶体非极性方向尺寸增加，与水溶液中的晶体形态明显不同。此外，对γ晶型在醇-水溶液中生长的研究表明，乙醇和水分子在γ晶型晶体表面上的吸附作用较强，难以去掉，所以完全抑制了其生长，从侧面说明了在醇-水溶液中不易得到γ晶型的原因。

综上所述，从成核的角度考虑，不同组成的溶剂能影响溶液中分子聚集体的比例，因此倾向于得到不同晶型的晶核。从生长的角度考虑，晶体的生长速率和晶面上溶剂分子的脱落速度有关，而溶剂分子在不同晶型的不同晶面上吸附作用不同，最终可选择性得到特定的晶型。因此，在调控氨基酸多晶型溶液结晶时，改变溶剂也是有效的方法之一。

4 结语

酸、碱、无机盐、溶剂组成、tailor-made添加剂、聚合物等均能有效影响氨基酸多晶型溶液结晶过程。

（1）酸、碱、无机盐等电解质添加剂能影响氨基酸的电荷结构，如可破坏甘氨酸分子的环状二聚体，抑制α晶型成核，促进链状二聚体的形成，从而促进γ晶型的成核。一价阳离子和二价酸根离子能促进晶体生长，而二价阳离子的抑制作用更明显。从电荷补偿的角度，电解质能破坏甘氨酸分子的自电荷补偿，破坏甘氨酸环状二聚体，形成开口二聚体促进γ晶型的成核。

（2）tailor-made添加剂与宿主分子结构相似，在L-谷氨酸、DL-蛋氨酸等溶液结晶过程中，tailor-made添加剂不仅能影响多聚体的形成，而且能掺入晶核中，最终影响成核。添加剂通过选择性地吸附在某一晶型的晶面上，可阻碍相应晶型的生长或向其转晶的过程。此外，tailor-made添加剂的结构越复杂，抑制转晶的作用越明显，同时官能团种类及数量、侧链基团的亲水和疏水性都能影响添加剂的作用。

（3）甲醇、乙醇等有机溶剂加入氨基酸水溶液中，可以改变溶液中甘氨酸、组氨酸不同类型分子聚集体的数量，从而影响成核；溶剂分子在晶体表面的脱落速度是影响特定晶体生长的重要因素。

虽然对添加剂调控氨基酸多晶型溶液结晶的研究取得了显著的成果，但是仍然面临着诸多挑战。如：甘氨酸多晶型结晶过程中碱如何影响成核和生长；作为tailor-made添加剂，甘氨酸如何促进多晶型转变等。随着科技的发展，各种分子模拟技术已经成功应用到结晶领域，定量计算添加剂对结晶过程中分子聚集体、生长界面的影响或许能进一步解释其对不同晶型成核和生长的影响规律，帮助研究者设计出更高效的添加剂分子，在未来取得更多的研究结果。