异土木香内酯诱导慢性粒细胞白血病细胞BCR-ABL融合蛋白降解

陈 晨，高丰厚

上海交通大学医学院附属第九人民医院肿瘤科，上海 201999

慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是一种骨髓增生性肿瘤，BCR-ABL基因的异常表达是其显著特征；研究显示，该基因是由9号染色体上的C-ABL与22号染色体上的BCR相互易位形成的融合基因［1-2］。该融合基因编码的BCR-ABL融合蛋白具有较强的酪氨酸蛋白激酶活性，可通过激活多个信号转导途径使细胞发生恶性转化［3］。酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）——伊马替尼是美国食品药品监督管理局批准的首个用于临床的选择性TKI，可极大地改善CML患者的生存率［4-5］。然而，随着该药物的长期使用，临床上逐渐出现了伊马替尼耐受的情况［6］。尽管沿着既有的思路开发了第2代TKI如Nilotinib、Dasatinib，同样地也出现了耐药性报道［7］。因此，寻求靶向BCR-ABL蛋白的新策略与新药物仍然是目前克服BCR-ABL阳性肿瘤细胞耐药的主要研究方向。异土木香内酯（isoalantolactone，Iso）是从桉树属植物的根中分离出的内酯化合物［8］。研究［9］表明，其对多种肿瘤细胞具有细胞毒性效应，而对正常细胞则无明显毒性。基于此，本研究观察了Iso对伊马替尼敏感和耐药的CML细胞的效应，探讨其下调伊马替尼敏感和耐药CML细胞中BCR-ABL融合蛋白的分子机制，以期为CML耐药的相关研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及主要试剂

K562细胞（对伊马替尼敏感）和K562R细胞（对伊马替尼耐药）由上海交通大学基础医学院病理生理学系吴英理教授赠送。293T细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

Iso由吴英理教授赠送。主要试剂：蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、溶酶体抑制剂氯喹（chloroquine，CQ）和半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK（Selleck，美国），RPMI-1640培养基、DMEM培养基（HyClone，美国），胎牛血清（Gibco，美国），CCK-8细胞增殖和毒性检测试剂盒（Dojindo，日本），FITCAnnexin-V细胞凋亡检测试剂盒（BD Pharmingen，美国），SYBR Green荧光定量PCR试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司），Lipo 3000转染试剂（Invitrogen，美国）；剪切型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved poly ADP-ribose polymerase，cleaved PARP）抗体、剪切型半胱天冬酶3（cleaved caspase 3，cleaved CASP3）抗体、C-ABL抗体、半胱天冬酶7（caspase 7，CASP7）抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（CST，美国），CASP3抗体（Abcam，美国），辣根过氧化物酶结合兔抗鼠二抗、辣根过氧化物酶结合羊抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch，美国）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基分别培养K562和K562R细胞，在培养K562R细胞时需加入10µmol/L伊马替尼以维持其耐药性。同时，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养293T细胞。培养条件为37℃、5%CO2。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖能力 将处于对数生长期的K562和K562R细胞分别用完全培养液重悬，按照5×103个/孔接种至96孔板中。向其中分别加入2.5、5、10、20、40、80µmol/L Iso作为处理组，加入等体积的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作为对照组，于37℃、5%CO2条件下培养。采用CCK-8法分别于接种后0、24、36、48 h检测细胞活性，并用酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度。细胞增殖抑制率（%）=［1-处理组D（450 nm）/对照组D（450 nm）］×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 分别将K562和K562R细胞按照1×104个/孔接种至6孔板中，加入Iso使其终浓度为10µmol/L（即为Iso组），同时加入等体积的DMSO作为对照组。培养24 h后，收集细胞并按照试剂盒说明书进行细胞重悬，加入5µLAnnexin V-FITC和5µL PI染液，室温下避光孵育15 min，于流式细胞仪进行检测。

1.2.4 蛋白质印迹法检测细胞内蛋白表达 ①分别用不同浓度的Iso（2.5、5、7.5、10、20µmol/L，即为处理组）处理K562和K562R细胞24 h，对照组用等体积的DMSO；同时，用10µmol/L Iso处理K562和K562R细胞0、6、12、24 h。②分别用2µmol/L MG132、5µmol/L 3-MA、20µmol/L CQ预处理K562细胞1 h后，再加入10µmol/L Iso处理6 h；用50µmol/L Z-VAD-FMK预处理K562和K562R细胞1 h后，再加入10µmol/L Iso处理12 h。分别收集①、②实验的细胞，加入适当体积的1×SDS裂解液于100℃金属浴中裂解10 min，而后行SDSPAGE电泳。经转膜后用5%脱脂奶粉封闭，加入对应的一抗，包括剪切型PARP抗体（1∶1 000）、剪切型CASP3抗体（1∶1 000）、C-ABL抗体（1∶1 000）、CASP7抗体（1∶1 000）、β-actin抗体（1∶1 000）及CASP3抗体（1∶2 000），4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入二抗（1∶5 000）。室温孵育2 h，再经TBST洗膜后加入化学发光显影液进行曝光。

1.2.5 反转录和实时荧光定量PCR检测 采用10µmol/L Iso分别处理K562或K562R细胞0、6、12、24 h后，用TRIzol试剂抽提该2种细胞的总RNA，并按照反转录说明书将其反转录为cDNA。依据SYBR Green荧光定量PCR试剂盒的步骤行实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测，以β-actin为内参，BCR-ABL基因表达差异以相对表达量2-ΔΔCT展示。qPCR引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列Tab 1 Primer sequence for qPCR

1.2.6 构建CASP3和CASP7敲减的稳转细胞株 为敲减K562R细胞中CASP3和CASP7基因，首先需构建pLL3.7-shCASP3和pLL3.7-shCASP7质粒，敲减序列见表2。将293T细胞接种于6孔板中，并置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。按照Lipo 3000转染试剂说明书，将能表达病毒外壳的质粒psPAX.2和病毒膜蛋白质粒pMD2.G与上述构建的pLL3.7质粒同时转染293T细胞，培养48 h后收集带有病毒颗粒的培养基上清液，用其感染K562R细胞，筛选CASP3和CASP7敲减的稳转细胞株。随后，分别向CASP3、CASP7敲减细胞中加入10µmol/L Iso处理12 h，采用蛋白质印迹法（Western blotting）检测BCR-ABL蛋白的表达，方法同“1.2.4”。

表2 靶向敲减序列Tab 2 Target sequence of knockdown

1.3 统计学方法

采用Graphpad Prism 8软件对研究数据进行统计分析。定量资料以±s表示。组间差异采用Studentt检验或方差分析进行比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Iso对K562和K 562R细胞的增殖抑制效应分析

采用CCK-8法检测不同浓度的Iso于不同时间下对K562和K562R细胞的增殖抑制效应，结果（表3）显示，与对照组相比，Iso可抑制上述细胞的增殖，且呈剂量和时间依赖性。

表3 Iso对K562/K562R细胞的增殖抑制率分析（%）Tab 3 Analysisof proliferation inhibition rateof K562/K562Rcellsby Iso（%）

2.2 Iso诱导K562和K562R细胞凋亡效应的检测

采用流式细胞术检测Iso（10µmol/L）诱导K562和K562R细胞24 h的凋亡效应，结果（图1）显示，与对照组相比，Iso处理K562和K562R细胞后，发生凋亡的细胞比例明显增多（P=0.034，P=0.000）。

图1 流式细胞术检测Iso对K562和K562R细胞的凋亡诱导效应Fig 1 Apoptosisinducing effects of Iso on K562 and K562R cells by flow cytometry

2.3 Iso对K562和K562R细胞中BCR-ABL融合蛋白及凋亡相关蛋白水平的影响

用一系列浓度（0、2.5、5、7.5、10、20µmol/L）的Iso处理K562和K562R细胞24 h后，经Western blotting检测（图2A、B）显示，凋亡相关蛋白（包括剪切型CASP3和剪切型PARP）水平均显著增加，BCR-ABL融合蛋白水平呈剂量依赖性下降。同时，随着Iso（10µmol/L）作用CML细胞的时间延长，Western blotting结果（图2C、D）显示凋亡相关蛋白水平显著增加、BCR-ABL蛋白水平显著降低。

图2 不同浓度及作用时间下Iso对K562和K 562R细胞中凋亡相关蛋白和BCR-ABL融合蛋白水平的影响Fig 2 Effects of Iso on the levels of apoptosis-related protein and BCR-ABL fusion protein in K562 and K562Rcells at different concentrations and time

2.4 Iso对BCR-ABL mRNA水平的影响

为了探索Iso下调BCR-ABL融合蛋白表达的机制，采用反转录及qPCR检测BCR-ABLmRNA的表达水平。结果（图3）显示Iso处理K562和K562R细胞后，BCRABLmRNA的表达水平无明显变化。

图3 Iso对K 562细胞（A）和K562R细胞（B）中BCR-ABL mRNA水平的影响Fig 3 Effects of Iso on the level of BCR-ABL mRNA in K562 cells(A)and K562Rcells(B)

2.5 蛋白酶体抑制剂、自噬抑制剂和溶酶体抑制剂对Iso诱导K562细胞中BCR-ABL融合蛋白下调的影响

为进一步探究Iso诱导CML细胞中BCR-ABL蛋白的降解途径，采用蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂3-MA、溶酶体抑制剂CQ分别联合Iso处理K562细胞，结果（图4）显示上述3种抑制剂均不能阻断由Iso诱导的K562细胞中BCR-ABL蛋白的降解。

图4 蛋白酶体抑制剂MG132（A）、自噬抑制剂3-MA（B）和溶酶体抑制剂CQ（C）对Iso诱导BCR-ABL融合蛋白下调的影响Fig 4 Effects of proteasome inhibitor MG132(A),autophagy inhibitor 3-MA(B)and lysosomal inhibitor CQ(C)on the down-regulation of BCR-ABL fusion protein induced by Iso

2.6 半胱天冬酶抑制剂对Iso诱导K 562和K 562R细胞中BCR-ABL融合蛋白下调的影响

为探究半胱天冬酶活性是否参与Iso诱导的CML细胞中BCR-ABL融合蛋白的降解，采用半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK联合Iso处理K562和K562R细胞。结果（图5）显示Z-VAD-FMK作用后，CASP3活性形式（剪切型CASP3）及下游剪切型PARP均有所减少，表明ZVAD-FMK抑制了半胱天冬酶的活性。结果表明，Z-VADFMK能够部分逆转由Iso诱导的CML细胞中BCR-ABL蛋白的降解。

图5 半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK对Iso诱导BCR-ABL融合蛋白下调的影响Fig 5 Effects of caspase inhibition Z-VAD-FMK on the down-regulation of BCRABL fusion protein induced by Iso

2.7 CASP3和CASP7在Iso诱导K562R细胞内BCRABL蛋白下调作用中的比较

为了进一步证实半胱天冬酶的激活有助于Iso诱导BCR-ABL融合蛋白的降解，本研究通过构建CASP3和CASP7敲减的稳转细胞株，用Iso分别处理上述细胞。结果（图6）显示与NC组相比，敲减CASP7的细胞中CASP7表达量减少，但却不能逆转BCR-ABL融合蛋白的降解；而在敲减CASP3的细胞中，敲减CASP3则可部分逆转该融合蛋白的降解。

图6 CASP7（A）与CASP3（B）敲减对Iso诱导BCR-ABL融合蛋白下调的影响Fig 6 Effects of CASP7(A)and CASP3(B)knockdown on the down-regulation of BCR-ABL fusion protein induced by Iso

3 讨论

BCR-ABL融合蛋白可通过激活多种信号通路［如磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、核因子活化B细胞κ轻链增强子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）、JAK激 酶（Janus kinase，JAK）/信号转导及转录活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）等通路］促进细胞的存活和增殖，因此靶向BCR-ABL或将是治疗CML的有效方法［1-2，10］。越来越多的证据［7，11］表明，通过小分子化合物诱导BCR-ABL的降解可能是克服TKI耐药的有效策略。本研究发现，Iso可抑制CML细胞增殖且呈时间、剂量依赖性。值得说明的是，当使用2.5µmol/L Iso处理K562细胞时，其抑制率较低，且随着时间的增加组内存在一定的偏差，使得该组在不同时间点下的差异无统计学意义；但随着Iso浓度的增加，其抑制效果更为明显。此外，Iso可诱导CML细胞中BCR-ABL融合蛋白的下调，而不影响BCR-ABLmRNA水平；同时，蛋白酶体和自噬溶酶体途径均不参与Iso诱导BCR-ABL融合蛋白的降解过程。

近来的研究发现，caspase途径参与了BCR-ABL融合蛋白的降解。如藤黄酸可通过激活caspase系统下调BCRABL蛋白的表达［12］，抗氧化剂黄腐酚通过激活caspase而非自噬或泛素蛋白酶体系统（ubiquitin proteasome system，UPS）诱导BCR-ABL蛋白的降解［13］，而巯氧吡啶硫铂通过caspase激活来抑制BCR-ABL的表达［14］。本研究的数据显示半胱天冬酶抑制剂可阻断Iso对BCRABL的降解，这也提示Iso可通过半胱天冬酶的激活来诱导BCR-ABL蛋白降解。

在半胱天冬酶家族中，CASP3和CASP7参与了多个蛋白质的降解过程［15-16］。激活CASP3可促进法尼酰基转移 酶（farnesyltransferase，FTase）/牻 牛 儿 基 转 移 酶（geranylgeranyltransferase，GGTase）α亚基的裂解［17］，CASP7能够裂解肿瘤坏死因子受体1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）［18］，CASP3和CASP7也负责P53诱导的BCR-ABL降解［19］。本研究发现在CASP3敲减的K562R细胞中可部分逆转由Iso诱导的BCR-ABL降解，而CASP7的敲减对该降解无影响。这一结果提示，CASP3活化可能参与了Iso诱导的BCR-ABL融合蛋白的降解过程。然而，Iso如何活化CASP3、活化的CASP3如何参与BCR-ABL融合蛋白的降解，或可通过观察Iso如何作用于CASP3上游分子及活化的CASP3如何剪切BCR-ABL蛋白中氨基酸来阐明。

综上，本研究证实Iso可通过激活CASP3来诱导CML细胞中BCR-ABL融合蛋白的降解。该结果为探究Iso靶向降解BCR-ABL融合蛋白提供了实验基础，同时也为克服CML治疗中的耐药问题提供了新的线索。

参·考·文·献

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