CTRP2与冠状动脉阻塞患者侧支循环形成的临床关联及相关作用

汤 静，于晨溪，陈中丽，章安迪

上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科，上海 200023

《中国心血管病报告2018》研究报告［1］显示：心血管病死亡占城乡居民死亡原因的首位，高于肿瘤及其他疾病；心血管病现患人数2.9亿，其中冠心病患者有1 100万。研究［2-3］表明，侧支循环建立可以向阻塞的冠状动脉远端提供逆向或前向血流灌注，起到保护心肌免于缺血和坏死的作用，改善血流动力学，降低冠心病患者的死亡率。虽然冠状动脉侧支循环的建立与冠心病患者较差的预后相关，但侧支循环本身有利于缓解心绞痛症状，减少缺血损伤，同时有利于心肌梗死后血流的恢复［4-5］。Möbius-Winkler等［6］发现，每周10 h的中高密度锻炼可以增加侧支循环的建立，为冠心病患者提供潜在的血流灌注来源。外部反搏疗法可以增加内皮上的流体剪切应力触发动脉生成，已被证明可延长冠心病患者的运动时间，提高患者的生存质量［7］。这些研究表明，冠脉侧支循环在冠状动脉阻塞患者中可发挥保护心肌的作用，同时促进侧支循环的形成也成为治疗冠心病、改善患者预后的新方法。

侧支循环的形成包括2个主要过程：动脉形成和血管新生［8］。由于冠状动脉阻塞，施加在侧支内皮上的流体剪切应力增加，这是引起侧支动脉重塑的主要机制［9］。流体剪切应力通过细胞膜上传感器结构转导，激活内皮细胞，诱导细胞表达细胞因子、生长因子和黏附因子，促进单核细胞激活并黏附于内皮细胞［10］。单核细胞迁移到血管壁，转变为巨噬细胞并分泌细胞因子和生长因子，促进平滑肌细胞的增殖和侧支血管的重塑［11］。当侧支血管半径和壁厚增加使流体剪切应力恢复到正常水平时，平滑肌细胞生长停止［8］。激活的内皮细胞也可在低氧诱导因子1-α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）作用下，向缺氧部位迁移分裂，形成管腔，最终与阻塞冠脉远端形成吻合，建立血流［12-13］。

许多参与炎症、早期转录及血管新生的基因与侧支循环形成有关［14］。已报道［15］脂联素（adiponectin）可促进侧支循环形成。脂肪因子补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白家族（C1q/tumor necrosis factor-related proteins，CTRPs）是与脂联素结构类似的一组蛋白，与动脉粥样硬化密切相关［16-17］。CTRP家族至少包括15个成员，其中CTRP1表达水平与冠脉侧支循环形成呈负相关，而CTRP3则可促进冠脉侧支循环形成［18-19］。但目前，关于CTRP2对侧支循环的影响及调控机制了解有限，本研究主要探讨CTRP2对于冠脉阻塞患者侧支循环形成的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年9月—2019年12月在上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科住院并进行冠状动脉造影确诊为冠状动脉阻塞患者为研究对象。入组标准：冠状动脉主要血管（左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉）至少一支血管狭窄>50%。排除标准：①年龄>80岁者。②既往有冠状动脉介入治疗病史或冠状动脉旁路移植术患者。③陈旧性心梗、严重心脏瓣膜病、严重心功能不全患者。④严重肝肾功能不全者。⑤有急、慢性炎症性疾病及感染性疾病者。⑥近期手术或创伤的患者。⑦恶性肿瘤患者。⑧有周围血管疾病患者。最终筛选得到177名符合标准的患者。本研究经过上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会批准，所有患者提供知情同意书。

1.2 冠状动脉侧支循环情况分级

依据Rentrop分级标准［2］，对177例冠状动脉阻塞患者根据冠状动脉侧支循环情况进行分级，由低到高分为0级、1级、2级、3级。评分越高，表明侧支循环越丰富。本研究将0级、1级设为侧支循环形成不良组，共89例；2级、3级设为侧支循环形成良好组，共88例。

1.3 酶联免疫吸附测定检测CTRP2

在征得患者知情同意后，抽取患者外周静脉血5 mL，置于含肝素的抗凝管中，立即于室温下以2 012.4×g离心15 min，确认无溶血后抽取上层血浆于-80℃冻存，采用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血浆CTRP2表达水平，试剂盒由美国Aviscera Bioscience公司提供。

1.4 动物模型建立

清洁级C57BL/6小鼠12只（体质量20～22 g，4周龄），购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。动物生产许可证为SCXK（沪）2013-0018。所有动物实验流程按照上海交通大学医学院附属瑞金医院实验动物管理条例进行。通过手术方式完全结扎12只小鼠下肢股动脉，建立下肢缺血模型。随机选择6只小鼠作为对照组，另外6只小鼠作为CTRP2过表达组并于结扎区域局部注射CTRP2过表达慢病毒（4个区域点）。分别于结扎后即刻、7 d、14 d及21 d，通过激光多普勒仪测定血供恢复情况，并计算血供恢复比率。

1.5 内皮细胞成血管迁移

使用重组CTRP2蛋白，以基础培养基为对照，按照临床检测结果以50、100及200 pg/mL的剂量刺激血管内皮细胞8 h后，于Matrix Gel上检测血管环形成能力，并通过Transwell检测内皮细胞迁移能力，以观察其对于内皮细胞功能的影响。

1.6 统计分析

研究资料统计分析均采用SPSS 21.0统计软件进行。定量资料以x±s表示，定性资料以频数（百分率）表示。首先进行正态性和方差齐性检验，检验符合正态分布且方差齐，组间比较采用非配对t检验或χ2检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象临床特征

研究对象的年龄、性别及相关危险因素特征如表1所示。总体上，侧支循环形成良好与形成不良的患者在年龄、性别及冠心病相关危险因素上差异未显示显著统计学意义。

表1 研究对象的临床特征Tab 1 Clinical featuresof the study population

2.2 不同侧支循环冠状动脉阻塞患者CTRP2表达含量的差异

相比于侧支循环形成良好的患者，侧支循环形成不良的患者CTRP2有显著性下降（图1）（P=0.009）。而针对CTRP2与冠状动脉阻塞患者侧支循环评分的相关统计学分析则显示，CTRP2对侧支循环形成不良的风险比OR=0.889，95%CI0.844～0.936，P=0.000；提 示CTRP2表达水平升高可能与冠状动脉阻塞患者侧支循环形成不良风险的降低相关。

图1 CTRP2在不同侧支循环冠状动脉阻塞患者中的表达含量Fig 1 Expression level of CTRP2 in patients having coronary artery obstruction with different collateral growth

2.3 CTRP2对于小鼠下肢缺血模型血供恢复的作用

下肢结扎可显著性抑制小鼠下肢血供。相比于对照组，过表达CTRP2组小鼠，下肢动脉结扎后14 d及21 d血供恢复比率高于阴性对照（均P<0.05），说明CTRP2促进小鼠下肢缺血模型的血供恢复（图2）。

图2 CTRP2对于小鼠下肢缺血模型血供恢复作用Fig 2 Effect of CTRP2 on blood supply restoration in the mouse model of lower limb ischemia

2.4 CTRP2对于血管内皮细胞成血管迁移的影响

重组CTRP2刺激后，内皮细胞血管环形成能力和内皮细胞迁移能力显著高于培养基对照组，且与CTRP2浓度呈正相关（均P<0.05）（图3）。

图3 CTRP2对于血管内皮细胞功能的影响Fig 3 Effect of CTRP2 on thefunction of vascular endothelial cells

3 讨论

目前关于CTRP2的相关研究较少，特别是针对其与侧支循环以及血管新生的相关研究尚缺乏。本研究旨在探索CTRP2对冠状动脉阻塞患者中侧支循环形成的临床关联，并通过动物实验和细胞研究证明CTRP2具有潜在的促侧支循环形成作用。研究发现：在冠状动脉阻塞患者中侧支循环良好患者相较于侧支循环不良患者血浆CTRP2表达水平升高，CTRP2对于缺血后侧支循环具有明显的改善作用，且CTRP2在体外可促进血管内皮细胞成血管及迁移。

既往研究［18］发现CTRP1在体外抑制上皮干细胞血管新生从而抑制侧支形成，临床研究［20］也证实了CTRP1与侧支循环形成呈负相关。Akiyama等［21］的研究发现，CTRP3对内皮细胞具有促增殖、迁移作用，促增殖作用能被丝裂原活化细胞外信号调节激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）1抑制剂和p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）抑制剂所抑制，而促迁移作用仅能被胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2抑制剂阻断，表明该信号通路在CTRP3促内皮细胞增殖和迁移中起着重要作用。另一篇关于CTRP3的研究［22］表明CTRP3可能通过增加丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（protein kinase B，Akt）的活性，诱导HIF-1α表达和促进内皮细胞释放血管生成因子来发挥其血管生成作用。CTRP9通过脂联素受体激活AMP活化蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）/Akt信号通路，继而激活内皮型一氧化氮合酶（endothelia nitric oxide synthase，eNOS）发挥促血管生成作用，形成侧支循环［23］。

先前研究［24］说明CTRP2在调节碳水化合物和脂质代谢中发挥作用。Lei等［25］的研究发现Ctrp2基因敲除小鼠通过上调脂解酶的表达，促进脂肪组织脂解作用，肝脏三酰甘油分泌增加，肝脏大小和肝三酰甘油水平显著降低，但血浆三酰甘油却升高，进一步说明了CTRP2在脂质代谢中的重要作用。基于此，已有研究［26］探讨CTRP2表达水平与冠心病发病风险之间关系。但是CTRP2对于侧支循环建立的作用及分子机制仍不明。本研究发现，冠状动脉阻塞患者血浆CTRP2表达水平与冠脉侧支循环形成呈正相关；进一步动物模型通过结扎小鼠下肢，压迫血管造成下肢动脉阻塞，发现过表达CTRP2组小鼠血供恢复比率高于阴性对照组；最后细胞实验表明CTRP2可能通过促进内皮细胞成血管和迁移作用，促进侧支循环形成，但CTRP2促进内皮细胞成血管和迁移的具体分子机制仍有待研究。

综上所述，冠心病患者中侧支循环建立良好患者相较于侧支循环不良患者血浆CTRP2表达水平升高；CTRP2于动物体内促进侧支循环形成改善血供，于体外增强内皮细胞成血管和迁移能力；因此CTRP2可能具有调节冠状动脉阻塞患者侧支循环生成的作用，有望成为改善患者侧支循环的潜在靶点。

参·考·文·献

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