miR-877-3p对骨质疏松症小鼠骨髓间充质干细胞增殖能力的影响

童 徐，舒林径

1.重庆医科大学附属口腔医院修复科，重庆 401147；2.口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆 401147；3.重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆 401147；4.重庆医科大学附属口腔医院种植科，重庆 401147

骨质疏松症是以骨质丧失及骨破坏为特点的一类全身性疾病，严重影响人们的生活质量。该疾病与雌激素缺乏相关，尤其以绝经后女性高发［1］。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在骨髓中的多潜能干细胞，其能够分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞等［2-4］。因此，BMSCs在维持骨平衡稳态、维护骨健康中发挥重要作用［5］。BMSCs生物学特性的改变会打破骨平衡稳态，从而导致骨质疏松症的发生［6］。然而，其具体机制仍不明确。微小RNA（microRNA，miRNA）能够调控多种细胞的增殖、分化、凋亡，受到研究人员的关注［7-9］。细胞内miRNA表达的变化会导致细胞生物学特性的改变，从而导致疾病的发生。研究［10］发现，miR-877-3p能够促进细胞的分化；但尚无研究指出miR-877-3p能够调控BMSCs的增殖能力。本实验旨在研究绝经后骨质疏松症发生、发展过程中，雌激素的减少是否影响miR-877-3p的变化，并调控BMSCs的增殖能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 8周健康雌性WT C57BL/6J小鼠，购于重庆医科大学实验动物中心。动物生产许可证号为SCXK（渝）2018-0003，使用许可证号为SYXK（渝）2018-0003。将小鼠在SPF级动物房饲养，自由饮水及采食。所有动物实验经重庆医科大学附属口腔医院伦理委员会批准［2020年伦审（067）号］。

1.1.2 主要试剂及设备 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（天杭生物，中国）；α-MEM培养基（Gibco，美国）；实时荧光PCR（real-time PCR）试剂盒、RNA提取试剂盒（TaKaRa，日本）；茜素红、胰蛋白酶（Sigma，美国）；CKK-8试剂盒（Invitrogen，美国）；成脂诱导试剂、成骨诱导试剂（百恩维，中国）；siPORTTM转染剂（Ambion，美国）；miR-877-3p冻干粉（锐博，中国）；micro-CT检测仪（西门子，德国）。

1.2 实验方法

1.2.1 骨质疏松模型及假手术模型建立 手术在10 g/L戊巴比妥钠麻醉下进行。将40只小鼠随机分为卵巢摘除术后骨质疏松症组（OVX组，n=20）和假手术组（Sham组，n=20）。OVX组小鼠切除双侧卵巢，Sham组切除卵巢附近部分脂肪，分层缝合肌肉和皮肤层。

1.2.2 血清雌激素水平及骨参数检测 术后8周，小鼠头部及眶周消毒后眼球取血，离心取血清，用酶联免疫试剂盒测定血清雌激素水平。术后2个月，脱颈处死2组小鼠，多聚甲醛固定小鼠股骨48 h；micro-CT扫描检测2组小鼠骨参数，包括骨体积分数（bone volume fraction，BVF）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）及骨密度（bone mineral density，BMD）。

1.2.3 BMSCs培养及表型鉴定 取Sham组及OVX组小鼠股骨，在超净台内冰袋上去尽肌肉与筋膜，剪刀剪去股骨两端。注射器插入髓腔，将骨髓冲出，剪碎吹均成单细胞悬液，加入含FBS的α-MEM培养液，于37℃培养箱中常规培养。取状态较好的P3代BMSCs消化，用含3%FBS的PBS清洗后重悬，分别加入Sca-1、CD90、CD45、CD34抗体，4℃避光1 h，离心，弃上清液，用含3%FBS的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）清洗，重悬，流式细胞仪检测细胞表面抗原表达率。

1.2.4 BMSCs成骨诱导及观察

（1）茜素红染色观察 取P3代细胞，按照2×105个/孔密度接种于6孔板中，随后加入成骨诱导液培养，每3 d换液。培养21 d后，PBS清洗，多聚甲醛固定，PBS轻轻冲洗，去除多聚甲醛。茜素红染液染色，显微镜下拍照观察，利用分光光度仪检测吸光度［D（520 nm）］。

（2）碱 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase，ALP）染色 取P3代细胞，按照2×105个/孔密度接种于6孔板中，随后加入成骨诱导液培养，每3 d换液，培养7 d。PBS清洗，多聚甲醛固定，依照ALP检测试剂盒说明进行ALP染色，拍照观察，检测吸光度［D（520 nm）］。

1.2.5 BMSCs成脂诱导及观察 取P3代细胞，按照2×105个/孔的密度接种于6孔板中，加入成脂诱导液培养，每3 d换液。培养14 d后，PBS清洗，多聚甲醛固定，再用PBS轻轻冲洗，去除多聚甲醛。油红O染色，显微镜下拍照观察，利用分光光度仪检测吸光度［D（520 nm）］。

1.2.6PPARγ2和Runx2基因检测 将OVX组和Sham组P3代BMSCs进行成脂基因PPARγ2与成骨基因Runx2检测。提取2组细胞RNA，按照试剂盒说明进行反转录及合成cDNA，real-time PCR检测。PPARγ2上游引物为5′-GGGTCAGCTCTTGTGAATGG-3′，下游引物为5′-CTGATGCACTGCCTATGAGC-3′；Runx2上游引物为5′-TTCTCCAACCCACGAATGCAC-3′，下游引物为5′-CAGGTACGTGTGGTAGTGAGT-3′；Gapdh上游引物为5′-GACTTCAACAGCAACTCCCAC-3′，下游引物为5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.7 BMSCs增殖能力检测

（1）CCK-8法 将P3代BMSCs按照4×103个/孔的密度接种于96孔板，连续7 d每日定时检测细胞增殖能力。每孔滴入10μL CCK-8液，置于37℃培养箱中2 h，取出后用酶联免疫检测机测量吸光度［D（490 nm）］。

（2）细胞计数法 将P3代BMSCs按照4×103个/孔的密度接种于96孔板，连续7 d每日定时对细胞进行计数。

1.2.8 miR-877-3p表达检测 收集OVX组和Sham组P3代BMSCs，PBS清洗，参照试剂盒说明书提取总RNA及反转录合成cDNA。miR-877-3p上游引物为5′-UGUCCUCUUCUCCCUCCUCCCA-3′，下游引物为5′-UGGGAGGAGGGAGAAGAGGACA-3′；内参U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物为5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。具体反应条件及体系参照产品说明。

1.2.9 miR-877-3p转染及BMSCs增殖能力检测 取P3代BMSCs，以4×103个/孔的密度接种于96孔板，待BMSCs贴壁，按照miRNA转染试剂盒说明书将miR-877-3p mimics（miR-877-3p过表达组）、miR-877-3p inhibitor（miR-877-3p抑制组）、空白对照试剂control（对照组）进行BMSCs转染。步骤如下：用50μL不含血清的培养基稀释1μL转染试剂siPORTTM，轻轻混匀并室温孵育5 min；用50μL不含血清培养基分别稀释0.5μL（20µmol） 的miR-877-3p mimics、miR-877-3p inhibitor、control存储液，轻轻混匀，室温孵育5 min；将稀释后的转染试剂siPORTTM与稀释后的miR-877-3p mimics、inhibitor、control轻轻混匀，静置后分别加入含有BMSCs的96孔板，置于37℃的5%CO2培养箱中培养。分别采用CCK-8法和细胞计数法检测BMSCs的增殖能力。

1.3 统计学分析

采用SPSS12.0软件进行统计学分析。定量资料用x±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs鉴定

细胞表面抗原流式检测结果显示，间充质来源干细胞表面标志物Sca-1和CD90表达率分别为88.4%和90.3%，而非间充质来源干细胞表面标志物CD45和CD34的表达率分别为4.9%和0.3%（图1）。

图1 BMSCs流式细胞鉴定Fig 1 Flow cytometry analysis of BMSCs

2.2 血清雌激素水平的比较

术后8周，Sham组血清雌激素水平为（32.49±3.17）pg/mL，显著高于OVX组的（8.89±1.13）pg/mL，差异具有统计学意义（P=0.002）。

2.3 骨参数的比较

术后2个月，micro-CT骨参数检测结果（图2）显示，Sham组BVF、Tb.N、BMD均明显高于OVX组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。

图2 2组小鼠股骨micro-CT影像学表现及骨参数比较Fig 2 Comparison of micro-CT imaging features of femurs and boneparameters between thetwo groups

2.4 BMSCs成骨分化及成脂分化鉴定

BMSCs经过成骨诱导液培养7 d后，ALP染色（图3A）及定量检测（图3B）结果显示，OVX组ALP活性低于Sham组（P=0.004）。BMSCs经过成骨诱导液培养21 d后，经茜素红染色，显微镜下可见橘红色钙盐沉淀，Sham组橘红色钙化结节多于OVX组（图3C）；定量检测结果（图3D）显示Sham组吸光度明显高于OVX组（P=0.005）。

图3 2组BMSCs成骨能力比较Fig 3 Comparison of osteogenic ability of BMSCs between thetwo groups

BMSCs成脂诱导14 d后，经油红O染色，显微镜下可见成串脂滴（图4A）。定量检测结果（图4B）显示，OVX组吸光度明显高于Sham组（P=0.042）。

图4 2组BMSCs成脂能力比较Fig 4 Comparison of adipogenic ability of BMSCsbetween the two groups

Real-time PCR检测结果（图5）显示，OVX组BMSCs成骨基因Runx2的相对表达量低于Sham组，OVX组BMSCs成脂基因PPARγ2的相对表达量高于Sham组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。

图5 2组小鼠BMSCs Runx2 and PPARγ2表达量比较Fig 5 Comparison of expression levels of Runx2 and PPARγ2 in BMSCs between thetwo groups

2.5 2组BMSCs增殖能力比较

连续7 d采用CCK-8法检测2组BMSCs的增殖能力，结果（图6A）显示，Sham组BMSCs与OVX组BMSCs增殖能力从第4日开始逐步显现差异，Sham组BMSCs的增殖能力显著高于OVX组（均P<0.05）。同样，连续7 d细胞计数结果（图6B）显示，Sham组BMSCs的增殖能力也是从第4日开始，显著高于OVX组（均P<0.05）。

图6 2组BMSCs增殖能力比较Fig 6 Comparison of proliferation ability of BMSCsbetween thetwo groups

2.6 2组miR-877-3p表达量的比较

Real-time PCR检测OVX组和Sham组BMSCs miR-877-3p的表达水平，结果显示OVX组BMSCsmiR-877-3p相对表达量（0.23±0.04）明显高于Sham组（0.06±0.02），差异具有统计学意义（P=0.018）。

2.7 转染效率检测

将BMSCs转染miR-877-3p mimics后，miR-877-3p的相对表达量显著上升；转染miR-877-3p inhibitor后，miR-877-3p的表达显著下降。该结果证实转染有效（图7）。

图7 转染后BMSCs中miR-877-3p的相对表达量Fig 7 Expression of miR-877-3p in BMSCsafter transfection

2.8 转染miR-877-3p后BMSCs增殖能力变化

转染miR-877-3p后通过CCK-8法（图8A）和细胞计数（图8B）检测各组BMSCs的增殖能力，均发现各组BMSCs增殖能力从第4日开始逐步显现差异。miR-877-3p过表达组BMSCs增殖能力显著低于对照组，而miR-877-3p抑制组BMSCs的增殖能力显著高于对照组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。

图8 转染miR-877-3p后各组BMSCs增殖能力比较Fig 8 Comparison of proliferation ability of BMSCs in thegroupsafter transfection of miR-877-3p

3 讨论

雌激素缺乏在骨质疏松症的发生及发展中起着重要作用。绝经后骨质疏松症是女性最常见的疾病之一。伴随年龄增加，女性体内雌激素水平降低，骨质破坏逐渐增加。绝经期后女性的BVF、Tb.N、BMD等骨参数指标较绝经前明显降低。研究［11］发现，雌激素影响体内成骨细胞的形成与破骨细胞的破坏，进而调控骨的破坏与重建。BMSCs具有增殖和多向分化的潜能，在一定条件下能够分化为成骨细胞、成软骨细胞等，从而对体内骨平衡稳态有着重要的调控作用［12］。近年来，研究人员［13］发现，miRNA因其特有的转录后调控作用，在绝经后骨质疏松症的发生及发展过程中产生了较大影响。本研究构建小鼠雌激素缺乏所致的骨质疏松症模型，比较来源于骨质疏松症小鼠的BMSCs与假手术组的BMSCs中miR-877-3p的表达情况；并通过上调（下调）BMSCs中miR-877-3p的表达，观察miR-877-3p是否能够调控BMSCs的增殖，进而影响雌激素缺乏导致的骨质疏松症。

本实验发现，OVX组小鼠行卵巢摘除术8周后，雌激素水平较假手术组明显降低，BVF、Tb.N、BMD均下降，与Shuai等［14］研究结果一致。BMSCs作为成骨细胞的前体细胞，在骨质疏松症的发病过程中有重要作用。骨质疏松症与BMSCs相互影响的研究大多集中在骨质疏松症环境下BMSCs多向分化能力的生物学特性改变；而关于来源于骨质疏松症机体BMSCs增殖能力改变的分子机制，研究较少。Tan等［15］发现，TAZ能够通过PI3K/Akt通路促进BMSCs的成骨分化。Qi等［16］发现，来源于骨质疏松症病理环境下的BMSCs成骨能力较弱，骨再生与改建能力降低；但自噬能够保护BMSCs的成骨能力，进而减少骨质疏松症的发生。Wang等［17］发现，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain，leucine rich repeat and pyrin domain containing 3，NLRP3）炎症小体的激活能够抑制BMSCs的成骨能力，而BMSCs的成脂能力却明显提升，进而导致骨质疏松症的发生。本实验发现，来源于卵巢摘除术所致的骨质疏松症小鼠模型的BMSCs经成骨诱导后，成骨能力低于假手术组，而成脂能力却高于假手术组，与上述相关研究结果一致。来源于骨质疏松症小鼠的BMSCs增殖能力较假手术组弱，说明在骨质疏松症的发病过程中，可能存在某些分子影响BMSCs的增殖能力。miRNA是多种生理和病理过程的重要调节因子，并可能通过影响成骨细胞分化，在维持骨稳态中发挥关键作用［18］。Wang等［10］研究发现，miR-877-3p能够靶向调控Smad7的表达，进而调控肌纤维细胞的分化。有研究［19］指出，在转化生长因子β1诱导的成骨细胞分化过程中，miR-877-3p参与了成骨细胞前体细胞系MC3T3-E1成骨分化的过程。本研究发现，OVX组BMSCs中miR-877-3p表达水平高于假手术组，说明雌激素缺乏可能导致BMSCs中miR-877-3p表达升高，进而对BMSCs的增殖能力产生影响，导致骨质疏松症的发生。Li等［20］在膀胱癌的肿瘤抑制基因p16的启动子位点上发现了miR-877-3p的结合位点，通过高表达miR-877-3p，能够增加p16的表达，抑制膀胱癌细胞的增殖，提示miR-877-3p可能参与细胞增殖能力调控。Xu等［21］发现，miR-887-3p负调控STARD13，进而调控胰腺癌细胞的增殖能力，影响胰腺癌的进展。本研究得到相似结果：OVX组BMSCs中miR-877-3p表达升高，BMSCs增殖能力降低；体外下调miR-877-3p后，BMSCs的增殖能力有一定程度的升高。

综上，本研究发现，在雌激素缺乏导致的骨质疏松症病理环境下，BMSC中miR-877-3p表达升高，抑制了BMSC的增殖，但其涉及的相关靶基因调控机制有待进一步探索。

参·考·文·献

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