不同比例当归-赤芍药对配伍对热毒血瘀证模型大鼠的影响*

程江雪 郭东艳 史亚军 邹俊波 张小飞 周文晶 李佳奇

(1.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室,陕西 咸阳 712046)

当归、赤芍均首载于《神农本草经》，药用历史悠久。当归为治疗血虚病症的要药，其范围涵盖了各种血瘀之症；赤芍常用于祛瘀止痛，为治淤血阻滞所致诸证之良药。当归偏于补血、活血，赤芍偏于清热凉血祛瘀，二者常在治疗因偏血热的血虚而兼有瘀滞之证时，配伍使用[1]。在《中医方剂大辞典》[2]中的342首含有该药对的活血补血方剂中，二者组成比例以1∶1、1∶2和1∶3较为常用。药对的不同配伍比例可对药效的发挥产生不同程度的影响。

热毒血瘀证，是临床常见的复杂症候，常可见于多种慢性非传染性疾病如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤等，和多种传染性疾病如感染性非典型肺炎、乙型肝炎等，其临床病理表现包括发热、炎性因子浓度增加等，其治疗亟待解决[3-10]。赤芍已被证明具有治疗热毒血瘀证的作用[11]，且在治疗心系病的提取物组合物现代研究当中，当归与赤芍为常用组合药物提取物组合单元[12]。前期研究结果表明，该当归-赤芍药对配伍后对热毒血瘀证大鼠血液流变学和炎性因子水平的调节效果优于赤芍单独使用，当归-赤芍药对不同比例以及不同配伍方式配伍所得的活性成分含量均有所不同，且该药对以合煎的方式进行配伍，对于热毒血瘀证大鼠的改善作用优于其他配伍方式[13-14]。

基于此，本研究拟本研究对当归-赤芍药对的1∶1、1∶2、1∶3三种比例的合煎液对热毒血瘀证大鼠血液流变学、凝血功能及炎性因子等方面的调节作用进行对比，初步评价不同配伍比例对热毒血瘀证大鼠的影响。

1 实验材料

1.1实验动物 SD大鼠110只，♂，SPF级，体质量为(180～220)g，由成都生物科技有限公司提供，合格证号：0042974；生产许可证号：SCXK(川)2015-030；环境温度18～22 ℃，相对湿度40%～50%。

1.2药材与试剂 当归产于甘肃，为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根；赤芍产于山西，为毛茛科植物芍药Paeonialactiflora的干燥根，均由程虎印教授鉴定。分别精密称取一定质量的当归、赤芍干燥药材粗粉，混合均匀，使二者比例分别为1∶1、1∶2、1∶3且总质量相等，置于具塞锥形瓶中，加入8倍量水，浸泡0.5 h后，回流煎煮1.5 h，四层纱布过滤，得不同比例当归-赤芍药对合煎液，置于-20 ℃冰箱内保存备用。

角叉菜胶(上海源叶生物科技有限生物公司，批号YY18762)；脂多糖(Sigma-aldrich公司(美国)，批号20181127)；凝血酶原时间(Prothrombin Time，PT)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20190116)；活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time，APTT)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20190116)；大鼠白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)酶联免疫分析试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司，批号20190212)；大鼠肿瘤坏死因子α(Tumour necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫分析试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司，批号20190212)；柠檬酸钠(天津天士力化学试剂有限公司，批号20181221)；水合氯醛(上海山浦化工有限公司，批号20170601)。

1.3主要仪器与设备 KDC-160HR高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳公司)；ELX808酶标仪(BioTek(美国))；DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)；AL204分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

2 实验方法

2.1动物分组、造模与给药 将雄性SD大鼠110只，随机分为正常组、模型组、当归-赤芍(1∶1)高、中、低剂量组(DC1∶1G、DC1∶1Z、DC1∶1D)，当归-赤芍(1∶2)高、中、低剂量组(DC1∶2G、DC1∶2Z、DC1∶2D),当归-赤芍(1∶3)高、中、低剂量组(DC1∶3G、DC1∶3Z、DC1∶3D)，每组10只，各给药组以原药材3.6 g·kg-1、1.8 g·kg-1、0.9 g·kg-1灌胃给药，正常组及模型组给等体积的生理盐水14 d，给药组连续灌胃给药14 d。给药第12 d，除空白组外，其余各组进行热毒血瘀证大鼠模型的制备。方法如下：以腹腔注射角叉菜胶(Carrageenan,Ca)溶液5 mL·kg-1(质量浓度为10 mg·mL-1)，8 h后尾静脉注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)溶液1 mL·kg-1(质量浓度为1 mg·mL-1)。以注射LPS时为造模0 h，以尾部出现明显，肉眼可见的血栓即黑尾现象为造模成功。

2.2采血及指标检测 给药第14 d，各组采血前禁食12 h，自由饮水，以玻璃毛细管插入大鼠内眦静脉采血1.5 mL，置于枸橼酸钠抗凝的离心管中，备用；随后用10%水合氯醛(0.35 mL·100 g-1)麻醉大鼠，腹主动脉采血，分别置于肝素钠抗凝的血液生化管或非抗凝的离心管中存放。将枸橼酸钠抗凝离心管离心(3000 r·min-1，15 min)制备血浆，严格按照试剂盒说明书操作，测定PT和APTT。

将肝素钠抗凝的血液生化管存放血样送往陕西中医药大学第一附属医院检验科检测全血黏度(Whole Blood Biscosity，WBV)、血浆黏度(Plasma Viscosity，PV)、红细胞比容(Hematocrit，Hct)、红细胞变形指数(Erythrocyte Deformation Index，EDI)、红细胞聚集指数(Erythrocyte Aggregation Index，EAI)。将非抗凝离心管中的动脉血自然凝固10～20分钟，离心(3500 r·min-1，20 min)，取上清液，采用双抗体夹心法检测IL-6和TNF-α，检测严格按照酶联免疫分析试剂盒说明书操作。

3 结果

3.1对热毒血瘀证大鼠一般情况的影响 热毒血瘀证大鼠模型制备后，普遍在注射LPS 30 min后，大鼠出现扎堆，少动，反应迟钝，四肢无力等现象。其中，模型组大鼠尾部均出现了明显血栓，长度5～12 cm不等，爪甲颜色加深，且较各给药组大鼠活动明显减少，毛发竖起，打冷颤，体温升高，大便溏稀，眼部分泌物增多。各给药组大鼠在预防给药12天以及造模后给药2天后，以上症状均有所缓解，尾部血栓长度相对较短，个别组血栓不足1 cm；体温均较模型组低，但比正常组高。

3.2对热毒血瘀证大鼠血液流变学和凝血功能的影响 与空白组比较，模型组大鼠的PT和APTT显著减少(P<0.01)，且全血高、中、低切黏度、血浆黏度，Hct及EAI均显著升高(P<0.01)，EDI显著减小(P<0.01)，提示热毒血瘀证模型制备成功。与模型组相比，除DC1∶2D以外，其余各给药组均可不同的增加热毒血瘀证大鼠的PT(P<0.05或P<0.01)，其中以DC1∶3G效果最好(P<0.01)；除DC1∶1D以外，其余各给药组均可不同程度增加热毒血瘀证的APTT(P<0.01)，其中以DC1∶2G效果最好(P<0.01)。与模型组比较，DC1∶2G和DC1∶3G能显著降低各切变率下(200 ma·s-1、50 ma·s-1、5 ma·s-1、1 ma·s-1)的全血黏度(P<0.05或P<0.01)，且DC1∶2G效果优于DC1∶3G；除DC1∶1D外，其余各给药组均可降低血浆黏度(P<0.05或P<0.01)，其中，DC1∶2G、DC1∶2Z、DC1∶3G和DC1∶3Z四组效果较好，且效果相近；除DC1∶3D以外，其余各给药组均可显著降低Hct(P<0.01)，且DC1∶2G和DC1∶2Z最接近正常组；各给药组均可显著增加EDI(P<0.01)，且随着剂量增加，各给药组的效果均有所提升，其中，以DC1∶2G效果最好；各给药组均可显著降低EAI(P<0.01)，且DC1∶2G降低效果最为显著，最接近正常组水平。具体见表1。

表1 各组大鼠全血黏度、血浆黏度、红细胞比容、红细胞变形指数、红细胞聚集指数、血浆凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间的检测结果

3.3对热毒血瘀证大鼠炎性因子的影响 与空白组比较，模型组大鼠的IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.01)，提示热毒血瘀证大鼠模型制备成功。与模型组比较，除DC1∶1D和DC1∶3D外，其余各给药组的IL-6浓度均显著降低(P<0.05或P<0.01)，其中以DC1∶2G的效果最佳；与模型组比较，各比例高、中剂量组的TNF-α浓度均显著降低(P<0.05或P<0.01)，其中，DC1∶2G和DC1∶2G Z效果较好。具体结果见表2。

表2 各组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量

4 讨论

中医热毒血瘀证是一个动态变化的证候，是温病发展到营血分阶段常见的一种证候类型[15]。热盛伤津耗液使血液黏稠，热盛灼伤脉络使血行不利，热盛迫血妄行使血液离经，热盛阻遏气机以致气滞，这些过程均可导致血瘀[16]。热毒血瘀证的现代生物学基础首先是炎症反应并波及血液内各种成分变化和凝血机制变化，进一步会引起微循环障碍和血液流变的异常，最终导致组织器官的缺血、缺氧、血瘀和变性，其现代生物医学指标主要包括了血液流变学的异常变化以及炎性因子异常升高的表现[18-19]。因此，改善血液流变学、调节炎性因子水平对于热毒血瘀证的防治具有一定的价值。

中药配伍的减毒增效是中医的医学特色和医学优势[20]，药对是中药组方和中药配伍的最基本形式。赤芍对热毒血瘀证具有明确的治疗作用，根据前期研究结果可知，当归与赤芍配伍使用对热毒血瘀证大鼠的治疗作用效果优于赤芍单用。因此，在本研究中主要考察不同比例的药对配伍对热毒血瘀证大鼠血液流变学、凝血功能以及炎性因子的影响。

本研究首先利用LPS和Ca联合制备了热毒血瘀证模型，使其具有符合中医热毒血瘀证的临床症状，即模型组大鼠尾部均出现显著的血栓，炎性因子水平增高等，表明模型建立成功。其次，通过对比不同比例当归-赤芍药对对热毒血瘀证大鼠的影响可知，在三种比例中，当归-赤芍比例为1∶2时，其血液流变学指标、PT和APTT，以及TNF-α和IL-6水平等最接近正常组(P<0.01)，即改善血液流变学、凝血功能以及调节炎性因子水平效果最好。现代药理研究结果表明，在该药对中，芍药总苷、阿魏酸具有显著的抗血栓、抗凝血、抗炎等作用[21-22]；阿魏酸、藁本内酯对TNF-α和IL-1β等炎症因子的升高具有明显的抑制作用[23-25]。根据前期研究结果，二者比例为1∶2时，没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷、丹皮酚、藁本内酯、香草酸以及阿魏酸的溶出总量最大，其中，没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖和苯甲酰芍药苷6个成分的溶出量最大，推测该6个成分为当归-赤芍药对治疗热毒血瘀证大鼠的主要活性成分。

综上研究，不同比例的当归-赤芍对于热毒血瘀证大鼠的血液流变学指标与炎性因子水平具有不同程度的改善作用，当比例为1∶2时效果最好。但中药量效关系受诸多因素影响，药物剂量不同，其药效发生的改变可能不完全是量的叠加，也可能是质的改变。再者，在热毒血瘀证所致不同疾病中，炎性因子水平和血液流变学的特性不尽相同。因此，本研究可为当归-赤芍药对治疗热毒血瘀证提供一定的思路与基础，但其对于治疗属不同疾病的热毒血瘀证的药效物质基础、有效性、安全性、给药剂量等还应通过拆方研究、血清药物动力学、代谢组学以及量效关系研究等进一步探索。