雌激素对盆底功能障碍患者阴道壁成纤维细胞力学反应的影响研究

高丽红

（山西省吕梁市人民医院妇产科，山西 吕梁 033000）

盆底功能障碍是指因盆底支持组织退化、损伤及功能障碍所导致的一组疾病，包括压力性尿失禁、盆腔脏器脱垂、性功能障碍等。有报道称，我国女性盆底功能障碍的发病率高达40%～60%[1]。近年来的研究发现，生物力学与盆底功能障碍的发生发展密切相关。成纤维细胞是组成女性盆底支持系统的重要成分之一，其通过感知应力能调节相关基因的表达及蛋白质的合成，从而起到维持盆底结缔组织结构与功能的作用[2]。本文主要是探讨雌激素对盆底功能障碍患者阴道壁成纤维细胞力学反应的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至2020年1月期间在我院进行手术治疗的10例盆底功能障碍患者作为研究对象。其纳入标准是：性别为女性；具有进行手术治疗的指征；术前3个月内未应用过激素类药物；自愿参与本研究。其排除标准是：合并有结缔组织病或其他严重的妇科疾病；病历资料缺失；存在认知功能障碍。这些患者的年龄为55～60岁，平均年龄为（57.25±5.14）岁；其中，子宫脱垂患者有6例，压力性尿失禁患者有4例。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 DMEM高糖培养基，胎牛血清，胰蛋白酶，免疫组化试剂盒，逆转录酶，TRIzol试剂，Oligo （dT）18引物、Flexercell4000细胞加载系统，DNA扩增仪，酶标仪，Alpha凝胶成像系统。

1.2.2 细胞培养与鉴定 术后取患者的阴道壁组织块进行细胞原代培养，细胞融合后传代培养12代。制备细胞爬片，取原代培养后的细胞进行水浴加热处理，修复抗原，并进行免疫染色。

1.2.3 应力刺激 将3～5代对数期成纤维细胞接种在培养板上，每孔含4 mL的培养基、5×104个成纤维细胞。当细胞达到融合状态后，将其分为静态组和应力组。对静态组成纤维细胞不进行应力刺激处理，对应力组成纤维细胞加载外力进行应力刺激。应力刺激的条件是：正弦波，频率为0.3 Hz，牵拉10%，时间为12 h。

1.2.4 雌激素干预实验 卸载外力后，将应力组成纤维细胞分为空白对照组（空白组）、无水乙醇溶媒空白组（溶媒组）和雌激素干预组（雌激素组）。在溶媒组成纤维细胞中加入10-8mol/L的无水乙醇，在雌激素组成纤维细胞中加入10-8mol/L无水乙醇与17β-雌二醇配置成的溶液，对空白组不做处理。完成上述操作后，将各组成纤维细胞继续培养48 h。

1.2.5 扩增反应 采用Trizol法提取各组成纤维细胞的总RNA，进行逆转录合成cDNA。反应条件：反应体系为20μL，65℃下反应5 min，42℃下反应60 min，70℃下反应5 min。之后进行扩增反应，反应条件：反应体系为25μL，95℃下反应2 min，95℃下反应40 s，52℃下反应40 s，72℃下反应60 s，循环30次，72℃下反应5 min。引物序列详见表1。

表1 引物序列

1.3 观察指标

观察应力刺激下盆底功能障碍患者阴道壁成纤维细胞的形态改变。 比较静态组成纤维细胞与应力组成纤维细胞中Col ⅠmRNA、MMP-1mRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表达水平。比较空白组、溶媒组、雌激素组成纤维细胞中Col ⅠmRNA、MMP-1mRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表达水平。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 应力刺激下阴道壁成纤维细胞的形态改变

盆底功能障碍患者的阴道壁成纤维细胞在受到应力刺激前呈多角形或梭形排列，无明显的方向性；受到应力刺激后，阴道壁成纤维细胞呈长梭形排列，排列较规则，且排列方向多垂直于应力方向。

2.2 静态组成纤维细胞与应力组成纤维细胞中各指标表达水平的比较

与静态组成纤维细胞相比，应力组成纤维细胞中ColⅠmRNA、MMP-1mRNA的表达水平均更高，Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表达水平均更低，P＜0.05。详见表2。

表2 静态组成纤维细胞与应力组成纤维细胞中各指标表达水平的比较（%，±s ）

表2 静态组成纤维细胞与应力组成纤维细胞中各指标表达水平的比较（%，±s ）

组别 Col ⅠmRNA Col ⅢmRNAMMP-1mRNA TIMP-1mRNA静态组（n=10）1.062±0.047 0.592±0.128 1.310±0.139 1.431±0.392应力组（n=10）1.252±0.059 0.103±0.017 1.655±0.197 1.035±0.061 t值 7.965 11.975 4.525 3.157 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.006

2.3 空白组、溶媒组、雌激素组成纤维细胞中各指标表达水平的比较

与空白组成纤维细胞及溶媒组成纤维细胞相比，雌激素组成纤维细胞中Col ⅠmRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表达水平均更高，MMP-1mRNA的表达水平更低，P＜0.05。详见表3。

表3 空白组、溶媒组、雌激素组成纤维细胞中各指标表达水平的比较（%，±s ）

表3 空白组、溶媒组、雌激素组成纤维细胞中各指标表达水平的比较（%，±s ）

组别 Col ⅠmRNACol ⅢmRNAMMP-1mRNA TIMP-1mRNA空白组（n=10）1.239±0.023 0.210±0.062 1.505±0.117 1.139±0.046溶媒组（n=10）1.233±0.025 0.103±0.012 1.629±0.164 1.082±0.033雌激素（n=10）1.324±0.051 0.926±0.104 1.322±0.102 1.271±0.097 F值 3.097 9.005 4.124 3.765 P值 0.005 ＜0.001 ＜0.001 0.004

3 讨论

女性的盆底处于不同程度的力学环境下，盆底结缔组织中的成纤维细胞具有感应力，可将力学信号转化为生化信号，能通过调节细胞外基质的成分来适应力学环境的改变，维持盆底结缔组织功能和结构的平衡[3]。当女性的盆底结构发生力学改变后，可引起盆底功能障碍。本研究的结果显示，在应力作用下，女性阴道壁成纤维细胞的形态发生改变，细胞由多角形或梭形排列变为长梭形排列，且排列方向多垂直于应力方向。女性盆底结缔组织的特性受到细胞外基质的影响，细胞外基质中胶原代谢的变化会导致盆底结构的支持力发生改变，最终可引起盆底功能障碍。在应力刺激的作用下，女性阴道壁成纤维细胞成分（如胶原蛋白、纤维粘连蛋白等）的合成会发生改变。Col Ⅰ、Col Ⅲ是阴道壁成纤维细胞中主要的胶原类型，也是构成盆底结缔组织细胞外基质的重要成分。Col Ⅰ的硬度大，可起到支持盆底结缔组织的作用；Col Ⅲ的弹性大，可保证盆底结缔组织的弹性，二者共同维持着盆底支持系统的弹性和韧性。Col Ⅰ、Col Ⅲ表达水平的变化会影响盆底结缔组织的生物力学性质。MMP-1具有降解Col Ⅰ、Col Ⅲ的作用，而TIMP-1可与MMP-1结合，调节MMP-1对Col Ⅰ、ColⅢ的降解[4]。本研究的结果显示，受到应力刺激可导致女性阴道壁成纤维细胞中Col ⅠmRNA、MMP-1mRNA的表达水平增加，使Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表达水平降低。这说明，受到应力刺激可改善女性阴道壁成纤维细胞的胶原代谢状态，上调细胞外基质中Col Ⅰ的表达水平，下调Col Ⅲ的表达水平，使盆底结缔组织的结构增强、基质重塑。雌激素属于类固醇激素，可通过结合雌激素受体形成复合物，影响靶基因的转录，诱导胶原蛋白的更新，促进胶原蛋白的成熟，抑制胶原蛋白的降解[5]。本研究的结果显示，与空白组成纤维细胞及溶媒组成纤维细胞相比，雌激素组成纤维细胞中Col ⅠmRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表达水平更高，MMP-1mRNA的表达水平更低，P＜0.05。这说明，采用雌激素进行干预能在一定程度上改善女性阴道壁成纤维细胞受力后的代谢状态，促进胶原蛋白的合成，抑制胶原蛋白的降解，改变细胞外基质的成分，促进细胞重塑，改变阴道壁成纤维细胞对应力刺激的应答，这可能是雌激素改善盆底功能的重要机制之一。本研究也表明，雌激素对受力后阴道壁成纤维细胞的逆转效果有限，并不能完全对抗应力刺激的作用。

综上所述，盆底功能障碍患者的阴道壁成纤维细胞在应力刺激下可出现胶原代谢改变，用雌激素进行干预能在一定程度上改善阴道壁成纤维细胞胶原代谢的状态，阻止盆底功能障碍的进展。阴道壁成纤维细胞对应力刺激的应答及胶原代谢的改变有望成为盆底功能障碍治疗中的研究重点，而雌激素对盆底功能障碍的确切作用机制有待于进一步研究。