脂多糖诱导大鼠子宫内膜损伤模型的建立与评价

夏 燕，刘 露，林丹换，张梦莉，练 冰，覃春容

（南方医科大学附属深圳妇幼保健院生殖医学科，广东 深圳 518000）

近年来，随着人工流产术、清宫术等宫腔操作的增加，导致子宫内膜炎及子宫内膜过薄等情况逐年增多。子宫内膜过薄可导致不孕及胚胎反复种植失败（recurrent implantation failure，RIF）。由于子宫内膜损伤及损伤后修复过程的人体组织标本不易获得，因此对子宫内膜损伤方面的研究多局限于对超声检查获取的影像学资料进行研究。子宫内膜损伤动物模型的建立，成为研究子宫内膜损伤与修复的可行工具与方法，可为探索子宫内膜损伤的可能病因、子宫内膜的修复机制及促进子宫内膜的修复再生、改善妊娠结局等找到一个更为合理的研究载体。本研究利用不同浓度的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对大鼠进行宫腔灌注，尝试构建更符合子宫内膜损伤条件的大鼠子内膜损伤动物模型并验证造模是否成功，为下一步子宫内膜损伤修复机制的研究提供条件。

1 材料与方法

1.1 实验动物

性成熟、未交配的特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雌性SD大鼠（由上海西普尔-必凯实验动物有限公司实验动物中心提供）24只，其周龄为6～8周龄，体重为220～260 g。实验严格按照动物伦理学标准开展。对这些大鼠进行常规适应性喂养1周后，每周在固定时间对其进行阴道涂片检查，观察其动情周期。

1.2 试剂及仪器

LPS（由Sigma公司生产），生理盐水（由山东华鲁制药有限公司生产），正置显微镜（由0lympus 公司生产），组织脱水机（由湖北康强医疗器械有限公司生产），石蜡包埋机（由湖北泰维科技视野有限公司生产），石蜡切片机（由徕卡公司生产），IMS图像分析系统（由武汉华联科生物技术有限公司生产） ，PBS缓冲液（由无锡傲锐东源生物科技有限公司生产），10%的中性福尔马林（由Solarbio公司生产），无水乙醇（由上海润捷化学试剂有限公司生产），二甲苯（由上海润捷化学试剂有限公司生产），苏木素（由BASO公司生产），伊红（由BASO公司生产），石蜡（由Leica公司生产）。

1.3 分组及动物模型构建

将24只SD大鼠分为LPS 10 mg/mL组、LPS 20 mg/mL组（合称为LPS处理组大鼠）和对照组，每组各有8只大鼠。让三组大鼠禁食12～14 h后，用10%的水合氯醛对其实施麻醉。麻醉起效后，固定大鼠，使其腹部朝上。将细软管针轻轻插入大鼠的阴道内，分别向LPS 10 mg/mL组、LPS 20 mg/mL组和对照组大鼠的宫腔内注入100 μL浓度为10 mg/mL的LPS、浓度为20 mg/mL的LPS和生理盐水，完成建模操作。待三组大鼠清醒后，将其放回笼内进行常规喂养及持续观察。建模完成后48 h，将大鼠处死，取其血清及子宫。将每只大鼠的Y型子宫分成2份备用，将其中一份子宫浸泡于4%的多聚甲醛中进行固定。对子宫标本进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，采用IMS图像分析系统测量三组大鼠子宫内膜的厚度。在光镜下观察三组大鼠子宫内膜的厚度、腺体和血管的分布情况、各层细胞的形态学改变等。对三组大鼠的子宫标本进行免疫组化染色，观察CK19和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在子宫内膜及基层等部位的表达情况。

1.4 观察指标

观察造模后三组大鼠的一般情况（包括体重、子宫的外观、形态等）。观察造模后三组大鼠子宫的组织形态学特点及子宫组织中CK19和TNF-α的表达情况。

1.5 统计学方法

用GraphPad Prism 8软件对本研究中的数据进行处理，各组动物的体重等实验结果以平均值±标准误差（Mean±SEM）表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后三组大鼠的一般情况

造模后，三组大鼠的体重无明显差异（详见图1）。造模前对三组大鼠进行观察发现，其子宫外观呈粉红色，粗细均匀，有弹性和光泽。造模后，LPS处理组大鼠的子宫发白，质地变硬，对照组大鼠子宫的颜色及形态无明显变化。

图1 造模后三组大鼠体重的比较

2.2 造模后三组大鼠子宫的组织形态学特点

造模后，与对照组大鼠相比，LPS处理组大鼠的子宫内膜层明显变薄，宫腔腔隙增大，与肌层界限不清楚；其子宫内膜上皮和腺上皮细胞扁平化，内膜上皮细胞排列紊乱，间质充血水肿，腺体数量明显减少；LPS 20 mg/mL组大鼠子宫内膜层变薄尤为明显。详见图2。

图2 造模后三组大鼠子宫的组织形态学特点

2.3 造模后三组大鼠子宫组织中CK19和TNF-α的表达情况

CK19在正常大鼠子宫内膜上皮细胞中呈高表达。造模后，对照组大鼠子宫内膜上皮细胞中的CK19呈强阳性表达，在子宫肌层中也有表达，但主要以内膜上皮细胞表达为主；LPS处理组大鼠子宫内膜上皮的正常结构遭到破坏，上皮细胞结构不清，其子宫内膜上皮细胞中CK19的表达弱于对照组大鼠，且CK19在子宫肌层中的表达也弱于对照组大鼠；随着LPS剂量的增大，大鼠子宫内膜损伤破坏程度逐渐加剧，其子宫内膜上皮细胞中CK19的表达逐渐越低。造模后，对照组大鼠子宫内膜的结构较为完整，其子宫内膜和肌层中TNF-α的表达水平较低；LPS处理组大鼠的子宫内膜出现不同程度的损伤，TNF-α在其子宫内膜和肌层中均有表达；随着LPS诱导剂量的加大，大鼠子宫内膜和肌层中TNF-α的表达水平逐渐升高；LPS处理组大鼠子宫内膜和肌层中TNF-α的表达水平显著高于对照组大鼠。详见图3。

图3 造模后三组大鼠子宫组织中CK19和TNF-α的表达情况

3 讨论

子宫内膜炎、宫腔粘连、子宫疤痕、子宫内膜过薄、子宫内膜血供减少等子宫病变被临床上认为是引起RIF的主要因素之一。上述子宫病变可直接影响受精卵的着床及辅助生殖过程中孕卵移植的成功率。研究指出，子宫内膜过薄是导致部分育龄女性不孕的原因之一，而RIF是影响辅助生殖技术成功率的重要因素。单纯子宫内膜过薄患者和RIF患者都会因子宫内膜的容受性下降、子宫内膜局部血供减少而影响胚胎的着床，进而可导致其不孕。目前，通过改善子宫内膜的修复机制增加子宫内膜的血供，进而改善子宫内膜容受性的方法尚未见相关的研究报道。近年来，国内外的相关研究已尝试建立子宫内膜损伤研究的动物模型（所选实验动物主要有大鼠、小鼠、新西兰兔、恒河猴等，造模方法有机械性损伤法、化学损伤法、热损伤法、感染性损伤法、缺血性损伤法、电磁波损伤法及联合损伤法等），但尚未获得相对可靠的动物模型，且尚无针对子宫内膜损伤程度及子宫内膜损伤动物模型预后的评价标准。现阶段，建立单纯薄型子宫内膜动物模型的方法主要为高浓度乙醇宫腔注射损伤法[1]，也有学者通过热损伤法建立薄型子宫内膜动物模型[2]。有研究通过宫腔放置铜丝和机械搔刮造成的双重损伤构建新西兰兔宫腔粘连模型[3]、小鼠子宫内膜损伤粘连模型[4-5]等多种动物模型。本课题采用LPS宫腔灌注诱导法建立大鼠子宫内膜损伤模型[6]，效果显著，建模时间和LPS的用量均可控。该方法较细菌感染法、电损伤法等建模方法有明显优势[7]。大鼠的子宫由外至内可分为浆膜层、肌层和内膜层，其中内膜层最厚。大鼠子宫的组织结构与人类相似，均由不同作用的功能层和基底层组成，故本实验采用SD大鼠进行造模。

本实验的结果证实，LPS可有效地诱导大鼠子宫内膜损伤，LPS的最佳诱导剂量为20 mg/mL。LPS可作为一种损伤诱导剂成功构建大鼠子宫内膜损伤模型。