miR-3143对胃癌HS-746T细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

吴 菁，吕志武，蒋志勇，李奎生，刘 芳，黄明沂，肖 瑶

（1.深圳市宝安区福永人民医院消化内科，广东 深圳 518103；2.南方医科大学附属深圳宝安医院消化内科，广东 深圳 518101；3.武汉大学中南医院影像科，湖北 武汉 430071）

胃癌是一种发病率较高的消化系统恶性肿瘤，严重威胁人类的健康及生命安全[1]。近年来随着我国居民饮食结构的改变及幽门螺杆菌感染率的增加，胃癌的发病率逐年升高，且此病患者的发病年龄趋于年轻化。探究胃癌发生的分子机制，对胃癌的诊断和靶向治疗具有重要意义。miRNA是一类非编码RNA序列，广泛分布于真核细胞内，其长度约为23个核苷酸[2]。miRNA主要在转录后水平调节下游靶基因mRNA的稳定性，影响靶基因的表达[3]。近年来随着分子生物学的发展，研究miRNA在胃癌细胞中的作用为胃癌的分子靶向治疗提供了新的方向[4]。miR-3143是一种新发现的miRNA，参与乳腺癌细胞的代谢过程[5]。miR-3143对胃癌细胞功能的影响尚不明确。本文主要是探讨miR-3143对胃癌HS-746T细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

胃癌HS-746T细胞（购于中国科学院上海生科院细胞资源中心），胎牛血清和DMEM培养基（购于美国Gibco公司），miR-NC和miR-3143 mimic（购于广州锐博生物科技有限公司），Lipofectamine 3000转染试剂（购于美国Invitrogen公司），qRT-PCR试剂盒（购于日本TaKaRa公司），细胞周期检测试剂盒和细胞凋亡试剂盒（购于南京凯基生物科技有限公司），一抗GAPDH、TOP2A、Cyclin H和IAPs（购于美国Affinity公司），辣根过氧化物酶标记的二抗（购于武汉博士德生物科技公司）。

1.2 细胞培养和转染

采用含10%（体积分数）胎牛血清的DMEM培养HS-746T细胞，培养条件：温度为37℃，二氧化碳（carbon dioxide，CO2）浓度为5%。取对数生长期的HS-746T细胞接种于24孔板上，根据Lipofectamine 3000转染试剂的说明书对细胞进行转染，分别转染miR-3143 mimic（miR-3143组）和miR-NC（Control组），二者的终浓度均为50 nmol/L，24 h后收集细胞进行后续实验。

1.3 采用qRT-PCR法检测miR-3143和TOP2AmRNA的相对表达量

采用TRIzol（一种新型的总RNA抽提试剂）提取HS-746T细胞总RNA，反转录制备cDNA，以cDNA为模板采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）法进行扩增检测。根据2-ΔΔCt方法计算miR-3143和TOP2A mRNA的相对表达量。以U6为内参计算miR-3143的相对表达量，以GAPDH为内参计算TOP2A mRNA的相对表达量。miR-3143的上游引物为5’- AAGAAGCGCTTTACAATGTTAT-3’， 下 游 引物 为5’- CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。U6的 上 游 引物 为5’- GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’，下 游 引 物 为5’- GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。TOP2A的 上 游 引 物为5’-TGGCTGTGGTATTGTAGAAAGC-3’，下游引物为5’-TTGGCATCATCGAGTTTGGGA-3’。GAPDH的上游引物为5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物为5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.4 采用平板细胞克隆形成实验检测HS-746T细胞的增殖活力

将Control组和miR-3143组各1000个HS-746T细胞接种于6孔板上，在培养箱中培养2周左右，直至出现肉眼可见的克隆。弃去上清液，加入多聚甲醛在室温下固定35 min。弃去上清液，加入结晶紫染色液在室温下染色35 min。用流水洗去染液，在室温下干燥，用肉眼观察HS-746T细胞的克隆形成数。

1.5 采用流式细胞技术检测HS-746T细胞的细胞周期和凋亡情况

将Control组和miR-3143组HS-746T细胞消化收集，采用预冷的乙醇溶液（体积分数为70%）固定细胞8 h，加入核糖核酸酶A（RNase A）作用30 min，加入溴化乙锭避光孵育30 min。采用流式细胞仪检测两组HS-746T细胞的周期变化。将Control组和miR-3143组HS-746T细胞消化收集，分别加入异硫氰酸荧光素（fluorescein Isothiocyanate，FITC）标记的Annexin V试剂和溴化乙锭试剂，避光孵育30 min，采用流式细胞仪检测两组HS-746T细胞的凋亡率。

1.6 采用生物信息学技术预测miR-3143的下游靶基因

运用miRNA靶基因预测数据库miRecords和miRGator对miR-3143的下游靶基因进行预测。

1.7 采用Westernblot检测HS-746T细胞中TOP2A蛋白的表达

收集Control组和miR-3143组HS-746T细胞，采用RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）裂解HS-746T细胞并提取总蛋白，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白质。将分离出的蛋白质电转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用5%（质量分数）的脱脂牛奶在室温下封闭2 h。在一抗TOP2A（浓度为1:3000）、Cyclin H（浓度为1:1000）、IAPs（浓度为1:1000）、GAPDH（浓度为1:1000）中孵育过夜。洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（浓度为1:10 000），在室温下孵育1 h。按照超敏发光试剂盒的说明书对蛋白条带进行曝光、显影，测定拓扑异构酶Ⅱα（topoisomeraseⅡalpha，TOP2A）的表达情况。

1.8 观察指标

观察并记录miR-3143细胞的瞬时转染效率、miR-3143对HS-746T细胞增殖能力、细胞周期及细胞凋亡的影响。观察并记录miR-3143与靶基因的靶向关系及上调miR-3143对HS-746T细胞靶基因mRNA、蛋白表达的影响。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对本研究中的数据进行处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-3143细胞的瞬时转染效率

本研究进行qRT-PCR检测的结果显示，Control组和miR-3143组HS-746T细胞中miR-3143的表达水平分别 为（1.07±0.22）和（7.79±1.55），miR-3143组HS-746T细胞中miR-3143的表达水平是Control组的7.28倍，组间相比差异有统计学意义（t=4.30，P＜0.01）。这表明本研究进行miR-3143 mimics转染成功。

2.2 miR-3143对HS-746T细胞增殖能力的影响

本研究进行平板细胞克隆形成实验的结果显示，Control组和miR-3143组HS-746T细胞的克隆形成数分别为（175.70±22.29）个和（67.93±16.78）个，组间相比差异有统计学意义（t=3.86，P＜0.01）。这表明上调miR-3143的表达能抑制胃癌HS-746T细胞的增殖活性。详见图1。

图1 miR-3143对HS-746T细胞增殖活性的影响

2.3 miR-3143对HS-746T细胞细胞周期的影响

本研究采用流式细胞技术进行检测的结果显示，与Control组相比，miR-3143组G0-G1期的HS-746T细胞更多，S期的HS-746T细胞更少，差异有统计学意义（P＜0.01）。这表明上调miR-3143的表达能够将HS-746T细胞阻遏在G0-G1期。详见图2。

图2 miR-3143对HS-746T细胞细胞周期的影响

2.4 miR-3143对HS-746T细胞凋亡的影响

本研究采用流式细胞技术进行检测的结果显示，Control组和miR-3143组HS-746T细胞的凋亡率分别为（9.71±1.69）%和（18.63±2.59）%，组间相比差异有统计学意义（t=2.88，P＜0.05）。这表明上调miR-3143的表达能促进HS-746T细胞的凋亡。详见图3。

图3 miR-3143对HS-746T细胞凋亡的影响

2.5 miR-3143与靶基因的靶向关系

运用miRNA靶基因预测数据库miRecords和miRGator预测miR-3143的靶基因可能是TOP2A，互补结合序列详见图4。

2.6 上调miR-3143的表达对HS-746T细胞TOP2AmRNA表达的影响

本研究进行qRT-PCR检测的结果显示，Control组和miR-3143组HS-746T细胞中TOP2A mRNA的表达水平分别为（1.07±0.19）和（0.31±0.05），组间相比差异有统计学意义（t=4.98，P＜0.01）。这表明上调miR-3143的表达能显著抑制TOP2A mRNA的表达。

2.7 上调miR-3143的表达对HS-746T细胞TOP2A蛋白表达的影响

本研究进行Western blot检测的结果显示，与Control组相比，miR-3143组HS-746T细胞中TOP2A蛋白的表达明显降低，细胞周期蛋白Cyclin H的表达明显降低，细胞凋亡抑制蛋白IAPs的表达明显降低。详见图5。

图5 上调miR-3143的表达对TOP2A蛋白表达的影响

3 讨论

近年来的研究发现，在胃癌组织中存在多个异常表达的miRNA，miRNA的异常表达在胃癌发生、发展中的作用日益受到重视[6]。miRNA可作为癌基因或抑癌基因在胃癌细胞的增殖或凋亡中发挥作用。Ding等[7]研究发现，miR-146b-5p在胃癌组织中的表达下调，出现癌细胞淋巴结转移和远处转移的胃癌患者癌组织中miR-146b-5p的表达低于未出现癌细胞淋巴结转移和远处转移的患者，miR-146b-5p过表达可减弱胃癌细胞的增殖和迁移能力。He等[8]研究指出，miR-96-5p在胃癌细胞株和胃癌患者的血清样本中呈高表达，miR-96-5p在体外能显著加快胃癌细胞的生长。miR-3143是一个新发现的miRNA，其可影响乳腺癌细胞的代谢[5]。本研究将miR-3143转染至胃癌HS-746T细胞，结果发现，当miR-3143表达上调后，胃癌HS-746T细胞的克隆形成能力可明显降低，细胞周期进展减慢，细胞的凋亡增加，这表明miR-3143可发挥抑制胃癌HS-746T细胞的作用。miRNA抑制胃癌HS-746T细胞的主要机制是靶向互补结合靶基因mRNA的3’-UTR，促进靶基因mRNA的降解或抑制其翻译为蛋白，从而下调靶基因在细胞中的表达水平[9]。本研究利用miRecords和miRGator数据库预测miR-3143的靶基因可能是TOP2A。TOP2A基因位于17号染色体长臂，TOP2A蛋白可改变DNA的超螺旋结构，调控基因的复制和转录，在细胞周期、增殖、有丝分裂等过程中发挥着重要作用[10]。TOP2A蛋白在肿瘤组织（如前列腺癌组织、乳腺癌组织、胰腺癌组织）中的表达水平明显高于正常组织，其表达水平与患者对化疗的敏感度、预后等存在明显的相关性[11-12]。TOP2A蛋白在胃癌组织中呈高表达，与胃癌的恶性程度有关，下调TOP2A的表达可抑制胃癌细胞的生长和侵袭[13]。

综上所述，上调miR-3143的表达能有效地抑制胃癌HS-746T细胞的增殖活力，调控细胞周期，促进细胞的凋亡，这一作用机制可能与miR-3143能够抑制TOP2A基因的表达有关。miR-3143可能为胃癌提供新的基因治疗靶点。