尘螨D e rp1蛋白主要特性及其T细胞抗原表位预测

乔瑞红，韩海阳，张小宁，冯彦

山西医科大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科，山西 太原 030001

尘螨属于节肢动物门、蛛形纲、广腹亚纲的微型动物。有研究表明，屋尘螨（Der-matphagoides）、户尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）等尘螨种属可引起人类严重的过敏反应。早在1967年，生物学家VOORHORST等［1］就研究证实了粉尘螨和户尘螨可引起过敏性鼻炎、支气管哮喘、过敏性皮炎等多种变态反应性疾病，是室内主要过敏原。据调查表明，全球对尘螨过敏的人口约占10%，由尘螨引起的外源性哮喘占比达80%［2-4］。目前，诊疗指南把变应原特异性免疫治疗（specific immunotherapy，SIT）作为变应性疾病的一线治疗手段［5］，是可能改变过敏性疾病自然进程的唯一治疗方式。SIT可明显减轻甚至完全缓解患者症状，减少（或停用）对症用药；同时减少疾病的复发且有长期效果，可预防疾病发展（如过敏性鼻炎进展成为哮喘）；预防新过敏性疾病的发生；总体降低家庭和社会在过敏性疾病方面的支出，改善患者生活质量。目前临床用于尘螨的SIT多采用天然粗尘螨提取液，但天然尘螨提取液成分复杂，可能造成高敏体质患者严重的过敏反应，而重组尘螨可弥补此缺点［6］。

近几十年里，分子免疫学技术和生物信息技术发展迅速，细胞表位在线检测软件功能不断更新，且检测准确性及速度不断提升，总体检测技术有了明显进步。本研究通过检测尘螨Derp1 T细胞表位以获得有致敏原性的蛋白片段，为临床尘螨引起的过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）及哮喘（asthma，AS）的诊断和治疗奠定基础［7］。

1 材料与方法

1.1 D e r p1蛋白理化性质分析 通过NCBI基因库（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gene／）获得尘螨Derp1基因片段的核酸序列（LOC113791973，共1 400 bp；2019年7月14日更新）及其编码的氨基酸序列（XP_027197631，320个氨基酸）。Derp1基因序列（NW_020873513.1，共1 400 bp）：5′-AATATCATTTCAATCCATTCGATCATCATCATTTCCATTCTTTTTTCTTTCTCTCTCTAAAATCTAAAATCCATCCAACATGAAAATTACTTTGGCCATCGCCTCATTGTTGGCATTGAGCGCTGTTTATGCTCGTCCATCATCGATCAAAACTTTTGAAGAATACAAAGTTTGTTTTTGATTTATTCTGTTTTTTTTTCCATTTTATATAATTGCCATTTATTCTTGTTTCACCTTTGTTATATATTGTAGAAAGCCTTCAACAAAAGTTATGCTACCTTCGAAGATGAAGAAGCTGCCCGTAAAAACTTTTTGGAATCAGTAAAATATGTTCAATCAAATGGAGGTGCCATCAACCATTTGTCCGATTTGGTAAGTTGATAATCATTGATATGTTTATTGAAAATTTTAAAACCAAATTCTTATTATTAGTCGTTGGATGAATTCAAAAACCGATTTTTGATGAGTGCAGAAGCTTTTGAACACCTCAAAACTCAATTCGATTTGAATGCTGAAACTAACGCCTGCAGTATCAATGGAAATGCTCCAGCTGAAATCGATTTGCGACAAATGCGAACTGTCACTCCCATTCGTATGCAAGGAGGCTGTGGTTCATGTTGGGCTTTCTCTGGTGTTGCCGCAACTGAATCAGCTTATTTGGCTTACCGTAATCAATCATTGGATCTTGCTGAACAAGAATTAGTCGATTGTGCTTCCCAACACGGTTGTCATGGTGATACCATTCCACGTGGTATTGAATACATCCAACATAATGGTGTCGTCCAAGAAAGCTACTATCGATACGTTGCACGAGTAAGTTTGATTTCGAAAAATCAAATTCGATTAACATTCATCAAATTTTTTCTAAAAATTTATAGGAA-CAATCATGCCGACGACCAAATGCACAACGTTTCGGTATCTCAAACTATTGCCAAATTTACCCACCAAATGCAAACAAAATTCGTGAAGCTTTGGCTCAAACCCACAGCGCTATTGCCGTCATTATTGGCATCAAAGATTTAGACGCATTCCGTCATTATGAGTAAGTTTGCCAATCAATTGAATGATGCAATAAAATTAATGTTTTATTATCAATTTTTTAGTGGCCGAACAATCATTCAACGCGATAATGGTTACCAACCAAACTATCACGCTGTCAACATTGTTGGTTACAGTAACGCACAAGGTGTCGATTATTGGATCGTACGAAACAGTTGGGATACCAATTGGGGTGATAATGGTTACGGTTATTTTGCTGCCAACATCGATTTGATGATGATTGAAGAATATCCATATGTTGTCATTCTCTAAACAAAAAGACAATTTCTTATATGATTGTCACTAATTTATTTAAAATCAAAATTTTTAGAAAATGAATAAATTCATTCACAAAAATTAAA-3′；氨基酸序列（XP_027197631.1）：MKITLAIASLLALSAVYARPSSIKTFEEYKKAFNKSYATFEDEEAARKNFLESVKYVQSNGGAINHLSDLSLDEFKNRFLMSAEAFEHLKTQFDLNAETNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKIREALAQTHSAIAVIIGIKDLDAFRHYDGRTIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL。通过ExPA-Sy的ProtParam tool（https：／／web.expasy.org／protparam）分析Derp1蛋白氨基酸序列的理化性质，对Derp1蛋白的氨基酸组成、原子数目、分子式、相对分子质量、正负电荷量、等电点和稳定性等参数进行检测。登录ProtParam tool，提交Derp1氨基酸序列，然后计算参数。

1.2 D e r p1蛋白的跨膜区分析 一般来说，原核系统无法表达跨膜蛋白，而真核系统可表达跨膜蛋白。在线软件可检测蛋白中是否存在跨膜结构，并且检测跨膜蛋白的理化特征［8］。利用TMpred检测Derp1蛋白质的跨膜区特征。

1.3 D e r p1蛋白的C D4+T细胞抗原表位的预测 Net MHCIIpan 3.2 Serve可检测Derp1中肽段与H-2分子ClassⅡ的结合情况，能有效预测鼠H-2分子ClassⅡ的8种类型（H-2-IAb、H-2-IAd、H-2-IAk、H-2-IAq、H-2-IAs、H-2-IAu、H-2-IEd和H-2-IEk）。BALB／c小鼠MHC ClassⅡ类等位基因为H-2-IAd和H-2-IEd。登录软件，输入Derp1的氨基酸序列，选择15个氨基酸肽段长度作为检测标准，将H-2-IAd和H-2-IEd亚型作为检测亚型进行检测，输出结果中亲和力值代表肽段与MHCClassⅡ亚型的结合情况。

1.4 D e r p1蛋白的C D8+T细胞抗原表位的预测

1.4.1 NetMHC 4.0 server软件 NetMHC 4.0 server可检测Derp1中肽段与H-2分子ClassⅠ的6种亚型（H-2Db、H-2Dd、H-2Kb、H-2Kd、H-2Kk和H-2Ld）结合情况，BALB／c小鼠的MHC ClassⅠ类等位基因为H-2Kd、H-2Ld和H-2Dd。登录软件，提交Derp1蛋白的氨基酸序列，由于H-2分子ClassⅠ与9个氨基酸的肽段有更强的结合力，因此将检测肽段长度设定为9个氨基酸，选择与H-2分子ClassⅠ的各个亚型进行检测分析。输出结果中亲和力值代表肽段与MHC Class中亚型结合情况。

1.4.2 SYFPEITHI软件 SYFPEITHI（http／／www.syfpeithi.de／bin／MHCServer.dll／EpitopePrediction.htm）能分析Derp1中的肽段与H-2分子ClassⅠ的结合情况。该软件可切断肽链羧基端的蛋白酶体并对肽链进行加工及转运，计算3者得分。登录软件，选择H-2亚型，将肽段长度设定为9个氨基酸，提交Derp1的氨基酸序列，分析结果得分在前2%的肽段序列。

1.4.3 NetCTL软件 NetCTL 1.2 Server软件在检测抗原肽段与H-2分子ClassⅠ结合情况的同时，可切断肽链羧基端的蛋白酶体并分析对肽段进行加工及转运的速率，计算3者得分。登录软件，提交Derp1蛋白的氨基酸序列，选定A2、A3两个超类型，设置Weighton C terminal cleavage为0.15，Weight on TAP transport efficiency值为0.05，Threshold for epitope identification值为0.75。上述3者得分的加权和作为检测结果，反映H-2分子ClassⅠ与检测肽段相结合的灵敏度或特异性的高低。之后再对检测出的含有9个氨基酸且得分在0.75以上的肽段进行分析。

2 结果

2.1 D e r p1蛋白的理化性质 利用ExPASy的Prot Param tool在线软件对Derp1基因上的开放阅读框进行分析，开放阅读框长度为1 400 bp，编码320个氨基酸，其编码蛋白共4 980个原子，相对分子质量为36 078.4，分子式为C1598H2438N444O487S13。其中丙氨酸占比最高为10.9%，其余氨基酸占比均不足10%。由于氨基酸中Asp、Glu带正电荷，Arg、Lys带负电荷，因此，Derp1蛋白中正负电荷的比例为36∶29，理论等电点为5.65，蛋白的不稳定指数为37.68，是稳定蛋白。其脂肪为79.06，亲水性指数为-0.358，是疏水性蛋白。

2.2 D e r p1蛋白的跨膜区 采用TMpred软件对Derp1蛋白的跨膜区、区段起始和终止位点、相对膜的取向进行由外到内、由内到外等特征的分析，结果显示，Derp1蛋白存在的螺旋跨膜区分别为1-23、125-148位氨基酸处，两处螺旋区的总评分为2 786。见表1和图1。

图1 Derp1蛋白的跨膜区分析Fig.1 Analysis of transmembrane region of Derp1 protein

表1 Derp1蛋白的跨膜螺旋特征Tab.1 Characteristicsof transmembrane helical of Derp1 protein

2.3 C D4+T细胞抗原表位NetMHCIIpan 3.2 Server在线软件检测结果显示，各短肽与不同H-2亚型之间的结合有较大差异，但总体来说均存在一定数量的强弱结合短肽。其中H-2-IAd有24个弱结合位点，21个强结合位点，结合位点最多。而H-2-IEd有26个弱结合位点，0个强结合位点，结合位点较少。经该软件可检测出含有15个氨基酸的CD4+T细胞抗原表位肽。

2.4 C D8+T细胞抗原表位 经3种在线软件Net-MHC、SYFPEITHI和NetCTL对Derp1蛋白的检测分析，共找到6条CD8+T细胞抗原表位强结合肽，表位肽氨基酸序列分别为115-123、249-2576、262-270、300-308、203-211和246-272。见表2。

表2 3种软件对Derp1的CD8+T细胞抗原表位在线综合预测Tab.2 Comprehensive prediction of CD8+T cell epitopes of Derp1 by three software

2.5 C D4+T和C D8+T细胞抗原表位综合预测结果 将在线软件分析出的CD4+T与CD8+T细胞抗原表位进行汇总，查出CD4+T细胞优势抗原表位有21条，CD8+T细胞优势抗原表位有6条。总结分析两者优势表位，得到1条CD4+T细胞和CD8+T细胞共同优势表位肽段，位点为115-123，序列为RQMRTVTPI，见表3。

表3 Derp1的CD4+T和CD8+T细胞抗原表位综合预测结果Tab.3 Prediction results of CD4+T and CD8+T cell epitopes of Derp1

3 讨论

通过生物信息技术在线检测发现Derp1蛋白的相对分子质量、跨膜区、亲水性、疏水区、脂肪系数及不稳定系数分别为4 980个原子，相对分子质量为36 078.4，分子式为C1598H2438N444O487S13，蛋白的不稳定指数为37.68，是稳定蛋白；脂肪为79.06，亲水性指数为-0.358，是疏水性蛋白；与郭伟等［9］报道的结果相似。崔玉宝等［10］通过生物信息学技术预测Derp1为疏水蛋白；Derp1与Derf1同源性为82.19%；均与本文预测结果相符。赵蓓蓓等［11］研究结果显示，118-146氨基酸序列中包含一段T细胞表位肽，与本文结果相符。以上结果均表明了在线软件预测的可靠性，并且在很大程度上减少了实验经费，我们可以有选择地进行相关实验。

含T细胞表位肽治疗自身免疫性疾病的免疫治疗措施已经成为研究热点。这类肽可被T细胞检测，但如果仅有优势表位肽提呈给T细胞而无共刺激信号存在时，会诱导T细胞失能从而不能引起过敏反应［12-13］。目前过敏性疾病的主要治疗方法为SIT［14］，临床应用诊断治疗的SIT制剂治疗效果较好，但疗效尚需进一步提高。这类制剂均采用天然变应原提取物，成分复杂，有引起严重不良事件的可能，因此被禁用于不稳定性哮喘［15-16］。与天然变应原相比，重组尘螨变应原存在T细胞表位，可在引起T细胞免疫反应的同时降低与IgE的反应，从而获得高度特异性和低免疫原性的重组变应原。对重组变应原分子生物学特征等方面的研究为获得理想的重组蛋白奠定了基础。

生物信息学技术早期已被利用至医学领域，通过生物信息学技术的分析检测可获知病毒蛋白变异原蛋白、细菌、真菌等一系列病原微生物蛋白的理化性质，以及其生物功能和主要的功能基团。通过生物信息学技术的提前信息检测，也可提前检测可能的功能蛋白，进行进一步的实验研究验证，可大大缩短实验所需时间，减少实验经费，对进一步研究具有较好的指导意义。但生物信息学技术也存在缺点，由于在线检测数据库的不稳定性，相同的变应原可能会有不同的检测结果，其准确性、可靠性、稳定性等尚需进一步提高。