蔗糖异构酶PalⅠ在枯草芽孢杆菌中的异源表达及应用

张贺朋，王兵兵，李宪臻，李蓉

大连工业大学生物工程学院，辽宁 大连 116000

异麦芽酮糖（α-D-glucosylpyranosyl-1，6-D-fru-ctofranose）具有水解性缓慢且不易被微生物降解等生理功能［1］，作为甜味剂已被广泛应用［2-5］，但自然界存在极少。用蔗糖异构酶（EC5.4.99.11）转化蔗糖生产异麦芽酮糖是目前工业化生产的主要方法。由于蔗糖异构酶在催化蔗糖转化的过程中始终伴随着副产物单糖的生成，增加了后续产物分离时的难度并提高了成本，对生产质量控制不利［6-9］。

枯草芽孢杆菌为非致病性菌，具有不分泌内、外毒素的特性，常作为食品工业的生产宿主。该菌为革兰阳性，细胞仅有一层膜结构，蛋白可分泌到胞外，且外分泌蛋白能力相对较强。对枯草芽抱杆菌分泌机制己深入研究多年，具有良好的发酵基础，因此，该菌在高产、经济的重组蛋白分泌生产中具有先天的优势［10-12］。

本研究以来源于克雷伯菌LX3（KlebsiellaspLX3）的蔗糖异构酶PalⅠ基因构建在枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800中重组表达菌株，基于微生物以葡萄糖和果糖等单糖为速效碳源在培养过程中优先利用的原理，探索重组菌株在含蔗糖的培养液中发酵产酶催化底物蔗糖转化时减少副产物单糖的应用。

1 材料与方法

1.1 菌株及载体 感受态E.coli DH10B由中科院大连化物所赵宗保研究员课题组惠赠；枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800及载体pHT43购自武汉淼灵生物科技有限公司；pET28a-PalⅠ质粒由大连工业大学生物催化技术国家地方联合工程实验室构建并保存。

1.2 主要试剂及仪器 限制性内切酶、DNA连接酶、Ex Taq DNA聚合酶、primer STARDNA聚合酶、DpnⅠ酶及DNA片段纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；0.22μm滤膜购自德国默克密理博公司；IPTG及LB培养基购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Agilent 1260高效液相色谱购自美国Agilent公司；高效液相色谱柱SPHERISORB NH2（4.6 mm×250 mm，80Å）购自英国Waters公司。

1.3 引物设计及合成 根据来源于Klebsiella spLX3的蔗糖异构酶PalⅠ基因序列（NCBI：AY040843.1）设计RF-克隆引物［13］，上游引物43-Primer-F：5′-GTTTGCCGATTACAAAAACATCAGCCATGTCTTTTGTTACG-3′；下游引物43-Primer-R：5′-CGCTCATTAGGCGGGCTGCTTACCGCAGCTTATACAC-3′。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.4 重组质粒的构建 采用PCR法从pET28a-PalⅠ质粒克隆获得含有同源臂的目的片段PalⅠ，再通过同源臂扩增连接至pHT43载体上，构建重组质粒pHT43-PalⅠ。具体步骤如下：提取pET28a-PalⅠ质粒，以其为模板，进行PCR。PCR反应体系为：pET28-a（+）-PalⅠ2μL，43-Primer-F 4μL，43-Primer-R 4μL，dNTPMix 8μL，5×PS buffer 20μL，Primer STAR DNA polymerase 1μL，ddH2O 62μL。反应条件为：95℃5 min；94℃30 s，55℃1 min，72℃3 min，共30个循环；72℃10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收后，进行RF-克隆第2步［13］，PCR反应体系为：引物（RF克隆第1轮回收产物）2.5μL，pHT43 0.5μL，dNTPMix 2μL，5×PSbuffer 5μL，Primer STARDNA聚合酶0.25μL，ddH2O 15μL。反应条件为：95℃5 min；94℃50 s，65℃50 s，72℃8 min，共15个循环；94℃50 s，55℃50 s，72℃8 min，72℃20 min，共20个循环；4℃结束。PCR产物经DpnⅠ酶消化后转化至感受态E.coli DH10B中，37℃培养16 h；提取质粒，进行PCR鉴定，阳性质粒送吉林省库美生物科技有限公司测序。测序正确的重组质粒命名为pHT43-PalⅠ。

1.5 重组菌株p H T43-PalⅠ／B.subtilis WB800的构建 将重组质粒pHT43-PalⅠ电转化至枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800中，筛选阳性克隆并进行菌落PCR鉴定，鉴定正确后接种种子液进行保存。

1.6 重组酶PalⅠ的异源表达及其催化活性分析将重组菌pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800（试验组）进行活化，挑取单菌落制备种子液。按1∶100接种于LB培养基中；37℃扩增培养，用终浓度为0.5 mmol／L IPTG 16℃分别诱导表达10、24、36及46 h，表达产物进行10%SDS-PAGE分析，同时以pHT43／B.subtilis WB800为阴性对照组。取100μL粗酶液，加入含终浓度2%蔗糖的50 mmol／L（pH 6.0）磷酸盐，反应体系为1 mL，30℃，120 r／min摇床反应10 h；15 428×g离心10 min，取上清进行HPLC分析，色谱条件：流动相乙腈∶水=90∶10，柱温为40℃，进样量为10μL，每个样品上样3次。

1.7 重组菌在蔗糖培养基中转化的应用 配制含2%、4%、8%及12%蔗糖的LB培养基，发酵培养重组菌pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800，30℃诱导表达24 h及4%蔗糖浓度再诱导48 h，取发酵液，15 428×g离心10 min；除菌并用0.22μm滤膜去除蛋白，HPLC分析发酵液中的产物。

2 结果

2.1 重组质粒p H T43-PalⅠ的鉴定 菌落PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1 797 bp的目的基因片段，大小与预期一致，见图1。经测序鉴定基因序列无突变，表明pHT43-PalⅠ构建正确且已导入E.coli DH10B中。

图1 重组菌落pHT43-PalⅠ／E.coli DH10B PCR电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of recombinant colony pHT43-PalⅠ／E.coli DH10B

2.2 重组菌株p H T43-PalⅠ／B.subtilis WB800的鉴定 菌落PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见在1 500～2 250 bp之间扩增出1条目的条带，大小与基因片段PalⅠ相符，见图2。表明成功获得重组菌株pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800。

图2 重组菌株pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800 PCR产物电泳图Fig.2 Electrophoretic profile of PCR product of recombinant bacterial strain pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800

2.3 重组酶PalⅠ的鉴定 表达产物经10%SDS-PAGE分析，试验组与阴性对照组在相对分子质量66 400处可见1条差异条带，大小与目的蛋白重组酶PalⅠ相符；诱导时间从10 h延长至46 h，差异条带颜色逐渐增加。见图3。表明蔗糖异构酶PalⅠ在B.subtilis WB800中成功异源重组表达。

图3 表达产物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAEG profile of expressed PalⅠ

2.4 重组酶PalⅠ转化产物分析 发酵液经HPLC分析，底物蔗糖转化为二糖产物异麦芽酮糖及海藻酮糖，其中以异麦芽酮糖为主，并伴随单糖副产物葡萄糖及果糖的生成，见图4。

图4 重组酶PalⅠ发酵液与2%蔗糖反应10 h的色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of fermentation borth of PalⅠreacted with 2%sucrose for 10 h

2.5 重组菌p H T43-PalⅠ／B.subtilis WB800发酵转化产物分析 结果显示，在不同蔗糖浓度的LB培养基中，发酵液中重组酶PalⅠ可催化蔗糖转化为二糖产物，且以异麦芽酮糖为主产物；在6.8 min保留时间无明显色谱峰，表明副产物单糖作为速效碳源基本已被菌消耗；在含4%蔗糖的LB培养基中，随着发酵时间的延长，海藻酮糖含量基本不变，而异麦芽酮含量降低38%，表明重组菌并不能利用海藻酮糖，枯草芽孢杆菌能在蔗糖被完全转化后，可再水解异麦芽酮糖进行生长。见图5。在含12%蔗糖的培养基中，发酵表达蔗糖异构酶PalⅠ过程中同时催化蔗糖转化，利用重组菌消耗副产物单糖，24 h后产物二糖与单糖副产物之比最大可达92∶1，见图6。

图5 pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800对培养基中不同浓度的蔗糖转化比较Fig.5 Conversion of sucrose at different concentrations by pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800

图6 不同培养基中二糖主产物与单糖副产物的比值Fig.6 Ratio of disaccharide main product to monosaccharide by-product in different media

3 讨论

将蔗糖异构酶PalⅠ基因导入B.subtilis WB800后，异源重组外分泌菌株pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800可在发酵过程中将重组酶PalⅠ分泌表达至培养基内。将底物蔗糖添加至培养基中，可在表达重组酶PalⅠ同时催化蔗糖转化产物二糖，同时基于微生物会优先使用葡萄糖作为速效碳源的原理，可利用重组菌来消耗反应中产生的副产物单糖。基于以上考虑，在含不同蔗糖浓度的培养基诱导培养试验组pHT43-PalⅠ／B.subtilis WB800和阴性对照组pHT43／B.subtilis WB800，采用HPLC对发酵液中的各种糖组分分析发现，产物二糖异麦芽酮糖与海藻酮糖产量比、产物二糖与产物单糖的产量比的变化主要与培养基中蔗糖浓度和发酵时间有关。在含12%蔗糖的培养基中发酵表达蔗糖异构酶PalⅠ过程中同时催化蔗糖转化并消耗副产物单糖，24 h后产物二糖与单糖副产物的最大比值可达92∶1。

本研究成功构建了蔗糖异构酶PalⅠ在枯草芽孢杆菌中表达菌株，且可利用重组菌在含有蔗糖培养基中直接发酵催化蔗糖的转化，同时利用并消耗副产物单糖，降低反应中副产物的含量。