血清miRNA-1296 联合表皮生长因子受体检测对非小细胞肺癌患者预后评估价值的分析△

兰超，曹雷，刘娜

保定市第一医院1呼吸内科，3感染性疾病科，河北 保定 071000 2保定市第一中心医院影像科，河北 保定 071000

肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，具有较高的致死率。根据不同的病理类型可将肺癌分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非 小 细 胞 肺 癌（non- small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC 占所有肺癌类型的80%以上。多数肺癌患者在确诊时已是肺癌晚期，具有较差的预后。随着分子生物学的发展，生物标志物的检测能够为肺癌的预后提供有效的评估。miRNA 的表达与肿瘤细胞的生长、增殖、迁移等过程有关，影响包括肿瘤在内的多种疾病的发生与预后。miRNA-1296 与包括NSCLC 在内的多种恶性肿瘤的发生及预后有关。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种酪氨酸特异性蛋白激酶受体，同时在细胞信号转导过程中有重要的作用，与细胞的增殖、侵袭及肿瘤的转移有关。赵敏等研究表明，EGFR 在NSCLC 患者血清中的表达水平高于健康组，是治疗NSCLC 的主要靶点。胃癌细胞中经荧光素酶报告基因验证EGFR 是miRNA-1296-5p 的靶点。本研究通过检测NSCLC 患者血清miRNA-1296、EGFR 的表达水平，分析二者之间的关系及与患者预后的相关性，探讨二者血清检测对NSCLC 预后的评估价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015 年2 月至2017 年9 月于保定市第一医院确诊的NSCLC 患者。纳入标准：①经组织病理学检查确诊为NSCLC；②术前未进行放化疗或手术治疗；③临床资料完整。排除标准：①肝、肾等重大器官功能不全；②合并其他肿瘤疾病；③自身患有免疫性疾病。根据纳入、排除标准，共纳入61 例NSCLC 患者为NSCLC 组，其中男37 例，女24例；年龄39～78 岁，平均（60.29±9.65）岁；有吸烟史44 例；鳞状细胞癌26 例，腺癌30 例，其他肺癌5 例；根据《国际肺癌研究协会第八版肺癌TNM 分期》进行临床分期：Ⅰ期15 例，Ⅱ期31 例，Ⅲ期15 例；根据《2015 版世界卫生组织肺癌组织学分类》进行组织学分化程度分级：低分化13 例，中分化34例，高分化14 例。另选取同期健康体检者61 例为对照组，男35 例，女26 例；年龄38～79 岁，平均（58.63±10.17）岁；有吸烟史41 例。两组研究对象年龄、性别、吸烟史比较，差异均无统计学意义（

P

﹥0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂及仪器

RNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，逆转录试剂盒、定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒均购自日本Takara 公司，酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELΙSA）EGFR 试剂盒购自美国R&D 公司；引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司；qRTPCR 仪CFX96 购自美国BΙO-RAD 公司，Nanodrop one 2000 分光光度计购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血液样品采集 NSCLC 患者于住院次日清晨、对照组于体检当日清晨，抽取空腹血3 ml 至离心管中，4 ℃，3000 r/min 离心15 min，之后转移上清至新离心管中，保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3.2 qRT-PCR 检测 血清miRNA-1296 的水平利用RNA 提取试剂盒对所有受试者血清RNA 进行提取，对所提取RNA 浓度进行测定，利用逆转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA，之后qRT-PCR 检测血清miRNA-1296 水平，循环条件为：95 ℃60 s；95 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃30 s，共40 个循环。以

U6

为内参，采用2法计算血清miRNA-1296 相对表达量，实验操作严格按照试剂说明书进行。miRNA-1296 正向引物序列：5'-TTGTTAGGGCCCTGGCTC-3'，反向引物序列：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

U6

正向引物序列：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向引物序列：5'-CAGGGGCCATGCTAATCTT-3'。

1.3.3 ELISA 试剂盒检测 EGFR 的水平采用ELΙSA 双抗体夹心法对两组受试者血清EGFR 水平进行检测，严格按照试剂盒说明书进行实验操作。

1.3.4 随访 通过电话或门诊复查的方式对NSCLC 患者进行随访，记录患者生存状态，随访截止日期为2020 年5 月31 日。根据NSCLC 组患者随访期间是否死亡，将患者分为死亡组27 例，生存组34 例。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 血清miRNA-1296、EGFR 水平的比较

NSCLC 组患者血清miRNA-1296 水平明显低于对照组，而EGFR 水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01）。（表1）

表1 两组受试者血清miRNA-1296、EGFR水平的比较（±s）

2.2 不同预后NSCLC 患者血清miRNA-1296、EGFR 水平的比较

死亡组NSCLC 患者血清miRNA-1296 水平明显低于生存组，而EGFR 水平明显高于生存组，差异均有统计学意义（

P

﹤0.01）。（表2）

表2 不同预后NSCLC 患者血清miRNA-1296、EGFR 水平的比较（x-±s）

2.3 血清miRNA-1296、EGFR 水平对NSCLC 预后的预测价值

ROC 曲线分析结果显示，血清miRNA-1296 与EGFR 联合预测NSCLC 患者预后的AUC、灵敏度、特异度均高于二者单独预测结果。（表3、图1）

图1 血清miRNA-1296和EGFR单独及联合检测对NSCLC预后预测价值的ROC曲线

表3 血清miRNA-1296、EGFR 水平对NSCLC 预后的预测价值

2.4 miRNA-1296 与EGFR 的相关性分析

NSCLC 患者血清miRNA-1296、EGFR 水平呈负相关（

r

=-0.496，

P

﹤0.05）。

2.5 miRNA-1296、EGFR与NSCLC患者预后的关系

ROC 曲线分析结果显示，EGFR、miRNA-1296截断值分别为5.96 ng/ml、0.48，根据两者截断值，将NSCLC 患者分为miRNA-1296 高表达组（miRNA-1296 ﹥0.48，

n

=29）、miRNA-1296 低 表 达 组（miRNA-1296≤0.48，

n

=32），EGFR 高表达组（EGFR﹥5.96 ng/ml，

n

=28）、EGFR 低表达组（EGFR≤5.96 ng/ml，

n

=33）。随访期内，miRNA-1296 高表达组患者累积生存率为75.86%，明显高于低表达组的37.50% ，差 异 有 统 计 学 意 义（

χ

=9.764，

P

=0.002）；EGFR 高表达组患者累积生存率为28.57%，明显低于低表达组的78.79%，差异有统计学意义（

χ

=18.942，

P

=0.000）。（图2、图3）

图2 血清miRNA-1296低表达组（n=32）与高表达组（n=29）NSCLC患者的生存曲线

图3 血清EGFR低表达组（n=33）与高表达组（n=28）NSCLC患者的生存曲线

2.6 NSCLC 预后影响因素的Cox 比例风险回归模型分析

单因素Cox 比例风险回归模型分析表明，年龄、吸烟史、组织类型、TNM 分期、分化程度及血清miRNA-1296、EGFR 水平均可能是NSCLC 患者预后的影响因素。多因素Cox 比例风险回归模型分析表明，血清EGFR 水平高表达是NSCLC 患者预后的独立危险因素（

P

﹤0.05），血清miRNA-1296 水平高表达是NSCLC 患者预后的保护因素（

P

﹤0.05）。（表4）

表4 NSCLC 预后影响因素的Cox 比例风险回归模型分析

3 讨论

NSCLC 主要包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌等，其发生可能与吸烟、空气污染、遗传有关。随着医学技术的发展，肺癌在诊断、手术及靶向治疗方面均取得了一定的进步，但肺癌的预后并没有太大的改善，生存率仍较低。本研究对61 例NSCLC 患者进行随访，期间共有27 例患者死亡，病死率高达44.26%，说明肺癌患者具有较差的预后。因此，寻找NSCLC 有效的治疗靶点和生物预测标志物具有十分重要的意义。

miRNA-1296 是一种与恶性肿瘤有关的新型miRNA，其表达失调影响多种肿瘤发生及预后。Zhang 等研究表明，miRNA-1296 在神经胶质瘤组织和细胞系中明显下调，且miRNA-1296 低表达与患者的5 年总生存期有关。Xu 等研究表明，与癌旁组织及健康细胞系比较，miRNA-1296 在肝癌组织及细胞系中的表达降低，且与肝癌的转移和复发有关，可能是肝癌预后的生物标志物。Deng 等研究表明，NSCLC 组织和细胞中miRNA-1296 表达明显下调，且miRNA-1296的低表达是NSCLC预后的独立危险因素，并且miRNA-1296能够通过WNT信号转导通路抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭。本研究结果表明，NSCLC 患者血清miRNA-1296 表达明显低于对照组（

P

﹤0.01），且死亡组miRNA-1296 表达明显低于生存组（

P

﹤0.01），说明miRNA-1296 可能与NSCLC 的发生和预后有关。季昳弛等研究表明，血清miRNA-1296 表达对甲状腺乳头状癌具有一定的诊断价值。本研究ROC 曲线分析结果表明，miRNA-1296 对预测NSCLC 患者预后具有较高的灵敏度和特异度，截断值为0.48，提示当患者血清miRNA-1296 表达低于0.48 时，需注意患者日常护理与复查，从而避免患者病情恶化导致死亡。根据截断值将NSCLC 患者分为miRNA-1296 高表达组与miRNA-1296 低表达组，Kaplan-Meier 生存曲线分析结果表明，miRNA-1296 高表达组NSCLC 患者生存率高于miRNA-1296 低表达组，多因素Cox比例风险回归模型分析表明，血清miRNA-1296 水平高表达是NSCLC 患者预后的保护因素（

P

﹤0.05），提示miRNA-1296 水平可能与NSCLC 患者预后有关，可能是NSCLC 患者预后的潜在生物标志物和治疗靶点。

EGFR

基因位于人类7 号染色体p13-q22 区，是一种分布于上皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞等细胞膜外表的多功能糖蛋白，其主要有1186 个氨基酸残基，是细胞增殖和信号转导的受体。EGFR 参与代谢、生长和凋亡等多种生理和病理过程，研究表明EGFR 在乳腺癌、胃癌、结肠癌等肿瘤组织中过度表达，同时EGFR 也参与肺癌的发病机制。本研究发现，NSCLC 患者血清EGFR 水平明显高于对照组（

P

﹤0.01），死亡组患者血清EGFR水平明显高于生存组（

P

﹤0.01），提示血清EGFR表达可能与NSCLC 的发生和预后有关。唐微等研究认为EGFR阳性表达与肺腺癌分化程度、临床分期和淋巴结转移有关，可能与患者预后关系密切。本研究ROC曲线分析结果表明，血清EGFR水平对NSCLC预后具有较高的预测价值，截断值为5.96 ng/ml，提示当NSCLC患者血清EGFR水平高于5.96 ng/ml时需关注患者预后。根据所得截断值将NSCLC 患者分为EGFR 高表达组和低表达组，随访期间EGFR高表达组患者生存率低于低表达组，多因素Cox 比例风险回归模型分析表明，血清EGFR 水平高表达是NSCLC患者预后的独立危险因素，提示EGFR可能与NSCLC 患者预后有关，具体机制有待进一步研究。Jia等研究表明，miRNA-1296通过靶向EGFR 抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，从而影响胃癌的发生、发展。本研究结果表明，NSCLC 患者血清miRNA-1296 水平与EGFR 呈负相关，猜测miRNA-1296 可能通过调控EGFR 的表达进而影响NSCLC 的发生和预后，而相关机制有待进一步研究。本研究还发现miRNA-1296 联合EGFR 预测NSCLC 患者预后灵敏度和特异度高于二者单独预测，提示miRNA-1296 与EGFR 均可能是NSCLC 患者预后的潜在预测生物标志物和治疗靶点。

综上所述，NSCLC 患者血清miRNA-1296、EGFR 水平与患者的预后有关，二者联合检测可能对患者预后进行更有效的评估，从而使患者获得针对性的治疗。在NSCLC 患者中miRNA-1296 与EGFR 呈负相关，二者可能协同参与NSCLC 的发生和预后，可能是NSCLC 的潜在治疗靶点。然而，本研究仅对患者血清miRNA-1296、EGFR 水平进行检测，二者在NSCLC 中具体作用通路还需进一步研究。