60Co辐射选育的姬松茸新菌株J37农艺性状与降低重金属含量效应

陈 华，叶 菁，林 怡，王义祥，刘朋虎

（1.福建省农业科学院农业生态研究所，福建 福州 350003；2.福建省红壤山地农业生态过程重点实验室，福建福州 350003；3.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意义】姬松茸（Agaricus blazeiMurrill）又名巴西蘑菇，属担子菌纲、伞菌目、蘑菇科、蘑菇属，是一种名贵的食药兼用型真菌。姬松茸具杏仁香味，味纯鲜香，口感脆嫩，不仅是味道独特鲜美与食用价值颇高的食品，而且子实体富含多糖、糖蛋白复合体、核酸等生物活性物质，具有很高的药用价值[1]。姬松茸原产巴西、秘鲁，它是一种夏秋生长的腐生菌，生活在高温、多湿、通风的环境中，引进国内栽培多年，具有较好的适应性与丰产性。20 世纪90 年代初，福建省率先从日本引进姬松茸品种，由福建省农业科学院引种栽培获得成功[2]，此后逐步推广到各地。经过多年发展，姬松茸已成为福建省食用菌产业发展的重要增长点之一。目前，姬松茸产业发展中存在子实体重金属镉富集致使镉含量超标问题[3]，阻碍了姬松茸的高优生产与出口贸易，影响食品安全与农民增收。因此，选育高产、优质、低重金属含量的姬松茸新品种，是亟待协同攻关的技术难题之一，其深入探索与技术突破将对姬松茸产业的高质量绿色发展具有重要意义。【前人研究进展】有关姬松茸镉富集与影响因素及其响应机制研究取得一定的进展与成效；黄建成等[4-5]探讨了姬松茸镉累积特性，阐述了镉胁迫对菌丝及子实体生长发育的影响，杨春香等[6]系统开展了镉对姬松茸菌丝生长影响的研究，徐丽红等[3]阐述姬松茸对有害重金属镉的吸收富集规律并研究了控制技术，江枝和等[7-8]、刘朋虎等[9]人先后开展了60Co 辐射诱变姬松茸突变株选育及其子实体营养评价研究，并成功获得产量高且镉含量相对较低的姬松茸新菌株。【本研究切入点】项目组以姬松茸菌株J1 为出发菌株，采用60Co 辐射诱变技术进行不同辐射剂量梯度处理，通过对不同辐射剂量梯度处理的菌丝显微结构观察、分子标记验证和栽培试验对比，选育高产优质的姬松茸新菌株。【拟解决的关键问题】通过60Co 辐射诱变姬松茸J1，系统筛选产量高且子实体重金属含量明显低于J1 的若干新菌株，并进行一系列的遗传稳定性验证试验，系统观测并有效选育高产优质的新菌株。本文将总结并报道姬松茸新菌株（J37）选育过程及其农艺性状与降低重金属含量的效应，以期为姬松茸新品种选育及其绿色生产提供参考与借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

姬松茸J1，由福建农林大学国家菌草工程技术研究中心项目组提供。

1.2 技术路线

将姬松茸菌株J1 转接到PDA 培养基试管上，置于23～26 ℃培养，菌丝满管1 周后进行60Co 辐射，辐射剂量为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 KGy，剂量率为11.36 Gy·min-1。将经过60Co 照射后的菌丝试管置于26 ℃培养箱再培养3 d，转接到PDA 试管中于23～26 ℃继续培养，观察菌丝致死（全部干瘪）及其半致死（一半干瘪）状况并分别明确其原先相对应的辐射剂量。在半致死剂量条件下再辐照10 支，辐射后转管培养，连续转接4 次，每次转接培养300 根，挑选菌丝生长均匀、粗壮、扭结点多，且与原菌株差异明显的菌株进行后续的栽培试验与筛选，同时进行菌丝超微结构、SSR 标记验证试验，并通过产量、品质、低重金属含量等主要参数的比较及其综合评价，选出姬松茸新菌株J37。

1.3 出菇试验

将J1、J37 菌株接种于PDA 培养基上，分别观察姬松茸J1（对照品种）、J37 的菌落形态，然后进行床栽出菇试验，观察诱变菌株J37 与原菌株J1 子实体形态，对比2 个菌株子实体农艺性状、产量与若干重金属吸收累积状况等。

1.4 原料选择

栽培原料主要为稻草或芦苇、牛粪、碳酸氢铵、尿素、过磷酸钙、石灰、石膏等。前发酵：先将栽培料堆制发酵13～18 d，翻堆3～4 次，前发酵的pH 值为7.3～7.5。后发酵：将前发酵的栽培料移到3 层、4 层和5 层满格堆放，温度保持57～59 ℃，10 h，后下降到48～52 ℃，保持4～5 d，按照常规方法进行分床栽培。

1.5 栽培管理

制备麦粒种，播种量为每平方米1.5～2.0 瓶；播种管理：撒播，播种后第1～3 天密闭，促菌丝萌发，3 d 后开始通风让菌丝往下吃料；覆土的处理：选择沙壤土为好，适宜含水量为23%～24%，厚度3.5～4.0 cm，促菌丝爬土，爬土后再覆一层 1 cm 细土，通风，出现原基后提高菇房空气相对湿度为88%～92%，有利于出菇整齐，产量提高。

1.6 测定方法

姬松茸不同潮次的主要农艺性状、子实体产量、子实体必需氨基酸总量（按照常规酸水解方法处理并用岛津氨基酸自动分析仪测定）以及子实体镉（帕金埃尔默PE900Z 石墨炉原子吸收光谱仪）、铅（石墨炉原子吸收光谱仪）、砷（原子荧光光谱仪）、汞（原子荧光光谱仪）含量测定参照江枝和等[8]的方法操作。采用SPSS19.0 进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同生长潮次姬松茸新菌株J37 的农艺性状

2.1.1 不同生长潮次姬松茸J37 子实体的朵质量 由表1 可知，辐射诱变新菌株J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇的子实体平均朵重，分别比原菌株J1 提高46.81%、42.45%、42.06%和36.84%；不同潮次中，J37 与J1 间的差异均达到显著或极显著水平。J37 与J1 子实体朵质量都随着潮次的增加呈逐步降低的趋势；就第四潮子实体而言，虽然J37 朵质量与第一潮子实体相比降幅达52.23%，但仍然比J1 第三潮子实体11.38 g 还高10.9%。

2.1.2 不同生长潮次J37 子实体的盖质量 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子实体的平均盖质量分别比J1 提高61.68%、71.05%、73.78%和74.60%，J37 与J1 间的差异均达极显著水平。就第四潮子实体而言，虽然J37 盖质量与第一潮子实体相比降幅达36.42%，但仍然比J1 第一潮子实体盖质量10.70 g 还高2.8%。

2.1.3 不同生长潮次J37 子实体的盖直径 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子实体的平均盖直径分别比J1 提高22.86%、39.28%、37.50%和8.57%，第一至三潮菇中J37 与J1 间的差异达到极显著水平，第四潮菇中J37 与J1 间的差异达到显著水平。就第四潮子实体而言，虽然J37 盖直径与第一潮子实体相比降幅达13.16%，但依然略高于J1 第一潮子实体盖直径。

2.1.4 不同生长潮次J37 子实体的盖厚度 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子实体的平均盖厚度分别比J1 提高20.00%、46.55%、15.38%和32.08%，不同潮次中，J37 与J1间的差异均达到显著或极显著水平。就第四潮子实体而言，虽然J37 盖厚度与第一潮子实体相比降幅达22.0%，但仍然与J1 第一潮子实体盖厚度接近，差异不显著。

2.1.5 不同生长潮次J37 子实体的盖高度 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子实体的平均盖高度分别比J1 提高29.16%、17.40%、33.33%和16.82%，不同潮次中，J37 与J1 间的差异均达到极显著水平。就第四潮子实体而言，虽然J37 盖高度与第一潮子实体相比降幅达19.35%，但仍然比J1 第一潮子实体盖厚度还高4.16%。

2.1.6 不同生长潮次J37 子实体的柄质量 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子实体的平均柄重分别比J1 提高8.33%、19.17%、10.81%、4.17%，不同潮次中，J37 与J1 间的差异均达到极显著水平。就第四潮子实体而言，虽然诱变新菌株J37 与第一潮子实体柄质量相比降幅达8.33%，但仍然比原菌株J1 第一潮子实体柄质量还高1.19%。

表1 不同生长潮次姬松茸J37 菌株的农艺性状Table 1 Agronomic traits of J37 harvested in tides

2.1.7 不同生长潮次J37 子实体的柄直径 由表1 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子实体的平均柄直径分别比J1 提高27.27%、20.65%、17.24%和15.8%，不同潮次中，J37 与J1 间的差异均达到极显著水平。从第一潮开始到第四潮，J37 和J1 都呈现下降趋势，且下降幅度分别为28.57%和26.92%。

2.1.8 不同生长潮次J37 子实体的柄长度 由表1 可知，J1 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子实体的平均柄长度分别比J37 提高30.24%、36.67%、21.26% 和34.57%，不同潮次中，J37 与J1 间的差异均达到极显著水平。由此表明诱变新菌株J37，在柄长度方面短于原菌株J1。就柄长度变化而言，从第一潮开始，J37、J1 都呈现先高后低的趋势，且柄长度则分别依次为第二潮、第三潮为较高值。

2.2 不同生长代数姬松茸新菌株J37 子实体产量变化

由表2 可知，姬松茸新菌株J37 从第一代至第六代子实体的产量分别比原菌株J1提高30.1%、29.7%、24.2%、27.5%、33.0%和29.3%，子实体产量平均提高28.9%；且不同生长代数中，J1 和J37 间的差异均达到极显著水平。由此表明姬松茸新菌株J37 在产量方面优于原菌株J1。新菌株J37 从第一代开始的子实体产量（2 342 g·m-2）就优于原菌株J1（1 800 g·m-2），从第一代栽培到第六代，新菌株J37 则一直保持平稳的不减的势头，其第六代产量达到2 280 g·m-2，而原菌株J1 则显示先略有下降，随后又恢复的趋势，其第六代产量为1 763 g·m-2。结果表明，J37不仅高产而且稳定产，也显示J1 可能存在种性退化，需要进行更新换代。

表2 不同生长代数对J37 子实体产量的影响Table 2 Fruiting body yield of J37 of different generations

2.3 不同潮次姬松茸新菌株 J31 子实体的必需氨基酸含量

由表3 可知，辐射诱变新菌株J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇 和第四潮菇子实体的必需氨基酸含量分别比原菌株J1提高11.54%、12.42%、14.66%和15.92%，且差异均达极显著水平。由此表明诱变新菌株J37，在必需氨基酸总量方面优于原菌株J1。从第一潮到第四潮，J37 和J1 子实体的必需氨基酸含量都呈现出先高后逐步下降的趋势，但前后差异不显著。

表3 不同生长潮次J37 子实体的必需氨基酸与重金属含量Table 3 Essential amino acids and heavy metals in J37 harvested in tides

2.4 不同生长潮次姬松茸新菌株J37 子实体的重金属含量

2.4.1 不同生长潮次J37 子实体的镉含量 由表3 可知，辐射诱变新菌株J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇 和第四潮菇子实体的平均重金属镉含量分别比原菌株J1 降低37.91%、50.40%、51.26%和52.78%，且差异均达到极显著水平，表明诱变新菌株J37，在降低重金属镉方面的性能优于原菌株J1。在实验室栽培条件之下，无论是新菌株J37，还是原菌株J1，其子实体镉含量从第一潮到第四潮都呈现从高到低的变化趋势；到了第四潮，子实体镉含量分别到为3.30、7.10mg·kg-1；J37 四潮的子实体镉平均含量比J1下降了48.09%。

2.4.2 不同生长潮次J37 子实体的铅含量 由表3 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇 和第四潮菇子实体的平均重金属铅含量都相对较低，分别比J1 低62.03%、57.89%、55.30%和59.04%，不同潮次中，J1 和J37 间的差异均达到极显著水平。从第一潮到第四潮，J37 子实体的平均重金属铅含量基本维持在0.383 mg·kg-1，且保持相对稳定；J1 的子实体平均重金属铅含量虽也从第一潮次的1.08 mg·kg-1下降到第四潮次的0.83 mg·kg-1。J37 子实体的平均重金属铅含量比J1 下降了58.57%。

2.4.3 不同生长潮次J37 子实体的汞含量 由表3 可知，J37 的第一潮菇子实体的重金属汞平均含量（0.33 mg·kg-1）低于J1（0.38 mg·kg-1），不同潮次中，J1 和J37 间的差异均达到极显著水平。辐射诱变新菌株J37 的第二潮菇和第三潮菇子实体的平均重金属汞含量分别比原菌株J1 的子实体平均重金属汞含量降低38.46%和30.91%，差异达到显著水平。辐射诱变新菌株J37 的第四潮菇子实体的平均金属汞含量比原菌株J1 的子实体平均重金属汞含量低26.03%，差异达显著水平。

2.4.4 不同生长潮次J37 子实体的砷含量 GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》中规定，食用菌及其制品中砷的含量应维持在0.5 mg·kg-1以下。由表3 可知，J37 的第一潮菇、第二潮菇、第三潮菇和第四潮菇子实体的重金属砷平均含量比原J1分别低89.13%、76.55%、69.09%和66.25%，不同潮次中，J1 和J37 间的差异均达到极显著水平；J37 重金属砷含量比J1 平均降低了75.26%，且低于国家规定的食用菌中砷的含量。

3 讨论与结论

本研究采用60Co 辐射诱变技术，成功得到诱变姬松茸高产低重金属的姬松茸新菌株J37，与原菌株J1 相比，新菌株J37 不仅主要农艺性状较为优异、产量相对稳定，平均高于对照品种J1 28%以上，而且子实体中镉、铅、汞、砷等重金属含量显著降低；经过在福建省多个市区试点推广J37 新菌株，其丰产性与优质性都相对稳定，深受菇农群众喜爱。本研究结果可为今后姬松茸诱变育种提供有益的参考与借鉴，也为菇农生产提供更多的优良品种选择。

诱变育种是利用某些理化因子诱导菌种的遗传因子产生变化，通过筛选突变体产生新的菌株，其是一种比较有效的育种方法[10]。近年来，食用菌诱变育种发展迅速，已被成功应用于多种食用菌新品种的选育，比如香菇[11]、金针菇[12]、平菇[13]、灵芝[14]、杏鲍菇[15]、真姬菇[16]等。常用的理化诱变因子有：紫外线、60Co、激光、离子束、X 射线、硫酸二乙酯等[17-18]。人工诱变育种虽然操作简单，周期短，也可以应用于人工创造优良性状，如今已经成为食用菌新品种选育重要的技术方法，但后代筛选与鉴定的工作量比较大。本项目组以姬松茸菌株J1的担孢子为试验材料曾经获得2 个低镉新菌株[19-20]，用60Co 进行辐射，力求进一步筛选低重金属含量的姬松茸品种，近期项目组获得新菌株J37，该菌株子实体中重金属镉、铅、汞、砷的含量比原菌株J1 分别低48.09%、58.57%、26.03%、75.26%，可望作为低重金属姬松茸新品种在生产实践中推广应用。张卉等[21]以姬松茸菌丝原生质体为材料，用紫外线诱变获得产量显著提高的诱变菌株。颜春君等[22]利用60Co-γ 射线辐射尖端菌丝，获得1 株姬松茸优良菌株JB6，该菌株在菌丝生长速度、产量等方面都优于对照菌株。但由于诱变育种具有方向不可控性，且诱变育种工作量大，故今后应加强诱变育种机理及优良菌种筛选标准等方面的深入探索，力求为今后利用基因工程手段定向选育奠定基础。

生产实践表明，姬松茸生产栽培过程比较容易产生镉超标现象，这是由于姬松茸品种内在特性所决定的[3,23-24]，项目组采用60Co 辐射诱变而成功选育的新菌株J37，不仅子实体镉含量明显降低，而且子实体中汞、砷、铅重金属含量也显著降低，但其降低的原因或者机制还需要深入探讨，以求阐明内在控制因子与相应的规律，为姬松茸产业化绿色生产积累经验并提供生产标准。