土荆芥精油对小菜蛾幼虫表皮的渗透促进作用

赵建伟，陈艺欣，林 硕，陈 勇，田厚军

（福建省农业科学院植物保护研究所/福建省作物有害生物监测与治理重点实验室/农业农村部福州作物有害生物科学观测实验站/国家农业生物安全科学中心华东分中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意义】土荆芥Chenopodium ambrosiodesL.，黎科黎属，又称臭草、杀虫芥，是一种一年生或多年生的芳香性草本入侵植物，茎叶和果实都有强烈气味，原产美洲热带，极易扩散于农田中，广泛分布于世界热带及温带地区[1-3]。我国主要分布于福建、江西、浙江、江苏、台湾、广东、广西等省[4]。土荆芥作为一种入侵杂草，资源丰富，而土荆芥精油本身对害虫具有趋避、毒杀作用[5]，对病原菌有抑制作用[6]，还可作为化感物质影响细胞生长[7]，因此，如何将土荆芥变废为宝，发挥其在病虫害防治方面的作用具有重要的研究意义。【前人研究进展】有关土荆芥精油化学成分及生物活性[8-12]等方面已有一些研究报道。植物精油作为重要的杀虫剂增效剂，其药效一方面取决于它的毒性大小及有机体对他的解毒能力，另一方面则取决于穿透生物体表的难易[13]。昆虫对杀虫剂产生抗性一个重要原因就是农药对昆虫表皮渗透率降低，而植物精油则是改变昆虫表皮渗透率，从而影响其生长发育，相关研究已在家蝇（Musca domesticaL.）[14]、灰茶尺蠖（Ectropis GrisescensWarren）[15]、斜纹夜蛾（Spodoptera lituraFabricius）[16]、菜青虫（Pieris rapae）[5]、棉铃虫（Helicoverpa armigeraHübner）[17]等多种昆虫中报道。土荆芥精油的杀虫活性还表现对幼虫体内的乙酰胆碱酯酶呈明显的抑制作用，对羧酸酯酶呈激活后抑制的作用[18]。小菜蛾（Plutella xylostellaL.）属于鳞翅目菜蛾科，是世界上分布最广、对十字花科蔬菜危害最严重的蔬菜害虫。由于过度依赖化学药剂防治，小菜蛾对多种杀虫剂产生了严重抗药性[19,20]。全世界用于小菜蛾的防控成本以及小菜蛾对蔬菜造成的损失已超过50 亿美元[21]。目前土荆芥精油对小菜蛾幼虫表皮的渗透作用以及对化学药剂作用于昆虫表皮的渗透效果尚不清楚。【本研究切入点】通过研究土荆芥精油对小菜蛾表皮渗透促进作用，可以更深入地了解土荆芥精油对杀虫剂的渗透促进作用机理，并寻找小菜蛾表皮靶标作用位点的有效药剂，达到药剂减量高效杀虫的目的。【拟解决的关键问题】采用扫描电镜观察土荆芥精油对小菜蛾表皮超微结构的变化，以揭示其促渗机理；并利用气质联用仪测定了土荆芥精油对杀虫剂透皮吸收量的变化，为合理开发利用杂草资源及植物精油促进害虫持续控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 土荆芥精油

土荆芥Chenopodium ambrosiodesL.采自福建省福州市新店镇埔垱村福建省农业科学院植物保护研究所实验田（北纬26°07′30.74″，东经119°18′23.98″，海拔 6.3 m），生育期为开花前期，提取部位为花、叶、茎、种子。参照国家药典委员会[22]提取方法。

1.2 供试虫源

小菜蛾饲养参照田厚军等[23-24]的方法。小菜蛾蛹采自福建省福州市新店镇埔垱村福建省农业科学院植物保护研究所实验菜田（北纬26°07′30.74″，东经119°18′23.98″，海拔 6.3 m），种群扩繁饲养于福建省农业科学院植物保护研究所养虫室，饲养过程中未接触杀虫剂，饲养代数至少30 代以上。幼虫用甘蓝（Brassica oleraceaL.var.capitata）叶片饲养，待化蛹后将其单头分装到指形管中，用10%蜜糖水对羽化后的成虫进行养分补充，取生理状态和虫龄一致的试虫进行测定。饲养温度25 ℃±1.0 ℃，光照时间16 h·d-1，相对湿度（RH）65%～75%。

1.3 试剂与仪器

毒死蜱（Chlorpyrifos，纯度92%，浙江新农化工有限公司），氮酮（Aazone Laurocapram，纯度95%，郑州市新瑞化工有限公司），敌百虫（Trichlorfon，纯度90%，山东大成农药股份有限公司），氟虫腈（Fipronil，纯度96%，江西省宜春远大化工有限公司），戊二醛（Glutaraldehyde，纯度50%，国药集团化学试剂有限公司），叔丁醇（Tert-butanol，纯度99.5%，国药集团化学试剂有限公司）、0.1 mol·L-1pH=7.2磷酸缓冲液，KI（Potassium iodide，纯度99%，国药集团化学试剂有限公司），I2（Iodine，纯度99.5%，国药集团化学试剂有限公司）、蔗糖（Sucrose，纯度99.5%，国药集团化学试剂有限公司），蒸馏水。JFC-型镀仪镀膜，JSM-5310LV 型扫描电镜（上海凯悦电子科技有限公司）。气相质谱联用仪（Trace Gc ultra/DSQ，美国菲利根公司）。

1.4 扫描电镜观察

选取个体大小一致的小菜蛾3 龄幼虫，每个处理10 头，用尼龙纱笼将小菜蛾3 龄幼虫分别浸入500、1 000 mg·L-1的土荆芥精油、氮酮以及丙酮和蒸馏水中5 s 后取出，吸去试虫体上多余的药液，置于培养皿（Ф=9 cm），用甘蓝叶正常饲喂24 h[25]。

由于小菜蛾幼虫身体较软，为了使固定液渗入表面蜡质，用少量去污剂与固定液结合。首先将小菜蛾用体积分数为2.5% 的戊二醛（pH=7.2）固定24 h 后，用KI 组织导电液（2.0 g KI、0.2 g I2、100 mL双蒸水、0.2 g 蔗糖）浸泡8～10 h，然后用蒸馏水清洗样品，并用系列叔丁醇脱水，之后用叔丁醇浸没，置冰箱（≤4 ℃）中10 min 后，放人真空干燥器中干燥40～60 min，将干燥好的样品观察面朝上粘台，用JFC-1200 型镀仪镀膜，置于扫描电镜（20 kV加速电压）下观察，拍照。扫描后对图片的亮度、对比度稍作处理[26]。

1.5 幼虫表皮渗透率测定

小菜蛾处理方法：参照魏方林等[27]的方法，选取室内长期饲养、大小一致的小菜蛾3 龄幼虫，各药剂配置成丙酮液后，用点滴法（0.5 μL·头-1）以LD50剂量处理试虫。处理后置于垫有滤纸和放有新鲜甘蓝叶的培养皿（Ф=9 cm）中，光照培养箱内饲养，在处理后1、2、6、12、24 h 分别取出10 头试虫，置于淋洗器内，并用移液枪1 mL 丙酮，分10 次淋洗试虫表皮，淋洗液收集于3 mL 的容量瓶中，用丙酮定容。另取10 头未经任何药剂处理的3 龄幼虫，同样用1 mL 丙酮分10 次淋洗并定容至3 mL，作为对照。

菲尼根（Finngin）气质联用仪；检测器：离子肼质谱、电子轰击源（EI）；色谱柱：DB-5 MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm；载气：氦气（99.999%）；柱流量：1.0 mL·min-1；进样口温度：220 ℃，离子源温度250 ℃；色谱柱程序升温：初始温度80 ℃保持1 min，后以20 ℃·min-1升至280 ℃，保持11 min；标样进样量：1 μL。

1.6 统计分析

数据的统计分析均采用DPS 软件[28]。透皮吸收量和表皮渗透率数据均以采用“平均数±标准误（SE）”，采用单因素方差分析，邓肯氏新复差检验法（Duncan’s Multiple Range Test，DMRT）进行多重比较其显著性差异。

2 结果与分析

2.1 土荆芥精油对小菜蛾幼虫表皮蜡质层超微结构的影响

如图1 所示，扫描电镜观察结果表明，蒸馏水处理组（图1-A 和图1-B）小菜蛾幼虫体壁蜡质层结构紧密，有许多完整的刺状突起，蜡花之间的空隙非常小；土荆芥处理组（图1-C 与图1-D）的蜡质层结构较为松散，蜡花间隙较大，可以看到明显的结构性损伤，刺状突起变得比较平滑，刺状突下面表皮产生褶皱或不规则变形，部分刺状突起发生断裂。

图1 土荆芥精油对小菜蛾幼虫表皮蜡质层超微结构的影响Fig.1 Effect of WEO on cuticle wax layer of DBM larvae

丙酮处理组（图1-E 和图1-F）的蜡质层结构排列，蜡花间空隙小，但与蒸馏水处理组相比，部分刺状突起不完整的，有些微破损；氮酮处理组（图1-G 与图1-H）蜡质层结构的刺状突起排列较为松散，间隙较大，刺状突起变得比较平滑，刺状突下面表皮产生褶皱或不规则变形，与土荆芥精油处理组相当。表明土荆芥精油与氮酮对小菜蛾幼虫表皮具有相似的影响。

2.2 土荆芥精油对杀虫剂的透皮吸收量的影响

表1 结果表明，处理后1 h，土荆芥精油处理组的敌百虫在小菜蛾幼虫表皮的渗透率达62.27%，而敌百虫单剂处理组的渗透率仅为45.16%，氮酮处理组敌百虫的表皮渗透率为64.51%。而处理后24 h，土荆芥精油处理组敌百虫的渗透率为99.65%，氮酮处理组的为97.57%，表明土荆芥精油对敌百虫的表皮渗透有更好的促进作用，而且比渗透促进剂氮酮对敌百虫的表皮渗透促进作用更好。处理后1～2 h后，土荆芥精油与敌百虫混配后在小菜蛾幼虫表皮的累积透皮量与敌百虫单剂比较，差异均显著，达到氮酮水平。

表1 敌百虫的累积透皮量及表皮渗透率Table 1 Accumulative quantity and rate of trichlorphon penetrated through DBM exoskeleton

表2 结果表明，土荆芥精油对氟虫腈有显著的渗透促进作用，随着时间的增加，总体上氟虫腈的累积透皮量和表皮渗透率都逐渐增加。处理12 h 后，土荆芥精油处理组的氟虫腈表皮渗透率达99.08%，而氟虫腈单剂处理组的表皮渗透率仅为24.52%，氮酮的表皮渗透率为60.88%；处理24 h 后土荆芥精油与氟虫腈混配、氮酮的渗透率分别为99.34%和55.12%，由此表明土荆芥精油的促渗效果强于氮酮。处理后各个时间段，土荆芥精油与氟虫腈混配的累积透皮量与氟虫腈单剂比较，均有显著差异，达到氮酮水平。

表2 氟虫腈的累积透皮量及表皮渗透率Table 2 Accumulative quantity and rate of fipronil penetrated through DBM exoskeleton

表3 结果表明，土荆芥精油对毒死蜱的表皮渗透一定程度的促进作用，随处理后时间的增加，毒死蜱的累积透皮量和表皮渗透率都逐渐增加。与毒死蜱单剂相比，处理后12 h 的表皮渗透率增幅较大，达92.05%，而毒死蜱单剂的渗透率仅为88.72%，渗透促进剂氮酮的渗透率也只有89.50%。在处理后各个时间段，土荆芥精油和毒死蜱混配的累积透皮量与毒死蜱单剂比较，差异不显著，氮酮也是如此。

表3 毒死蜱的累积透皮量及表皮渗透率Table 3 Accumulative quantity and rate of chlorpyrifos penetrated through DBM exoskeleton

3 讨论与结论

本研究结果表明，土荆芥精油处理后，小菜蛾的表皮可以看到明显的结构性损伤，蜡质层结构的刺状突起排列变得比较松散，刺状突起变得平滑，刺状突下部变得褶皱或开裂，有助于化学药剂透过表皮层进入昆虫体内。而土荆芥精油通过对灰茶尺蠖（Ectropis GrisescensWarren）和菜青虫（Pieris rapae）幼虫表皮的渗透作用进而影响其生长发育，主要表现在化蛹率、后代产卵量、蛹重等生长指标均下降[5,15]；通过叶碟法测定薰衣草精油对斜纹夜蛾（Spodoptera lituraFabricius）的非选择取食和生长抑制，结果表明，薰衣草精油在较低浓度时会促进3 龄幼虫取食，在高浓度时会导致幼虫表皮结构破坏从而抑制其生长发育[16]；八角茴香果实精油对昆虫表皮的损害性较强，不仅对棉铃虫（Helicoverpa armigeraHübner）的生长发育有显著的抑制作用，而且大幅提高其3 龄幼虫的死亡率[17]。综上所述，植物精油对昆虫的生物活性均表现在与昆虫接触后对其表皮结构造成一定的损伤以提高其渗透速率。

促进药物经皮吸收有多种方法，其中促渗剂的利用最为广泛，将药物与促渗剂结合，利用促渗剂与皮肤类脂或蛋白质结构发生相互作用而增加药物渗透[29]。根据昆虫抗性机理研究报道，影响药剂渗透的主要因子是昆虫的上表皮结构，尤其是上表皮最外面的水泥层－蜡质层的组成和厚度[30]。药剂要首先溶入蜡质层，然后再按照其分配系数渗透上表皮和原表皮[31]。从扫描电镜观察结果可知，土荆芥精油处理后，小菜蛾幼虫表皮蜡质层受到了一定程度的损伤或影响，刺状突间隙增大，结构排列比较松散，部分刺状突发生断裂现象，这与土荆芥精油作为渗透促进剂的作用机理，即改变角质层的通透性，减低药物经皮渗透的阻力，提高药物在皮肤角质层的扩散系数是相一致的[32]。因此，把土荆芥精油作为一种渗透促进剂来研究开发是完全符合土荆芥精油本身特点。本研究结果也可为土荆芥精油应用于其他有机磷、苯基吡唑类和硫代磷酸酯类杀虫剂提供理论依据。

脂质是昆虫表皮的重要组成成分，其中体表脂质是昆虫维持正常生命活动的第一道防护屏障。对于化学药剂来说，突破昆虫表皮的防护屏障来杀死昆虫至关重要，本研究初步探讨土荆芥精油对小菜蛾表皮的渗透效果，并与几种化学药剂复配以验证土荆芥精油对化学药剂的增效作用，发现土荆芥精油的确具有提高农药杀虫效果的潜力，后续我们将深入开展土荆芥精油对复合药剂的增效作用研究以及对重要害虫的表皮渗透促进作用，如采用透射电镜扫描，进一步观察土荆芥精油对小菜蛾表皮结构及其皮下结构的影响，更加深入地阐明土荆芥精油对小菜蛾表皮的渗透促进机制；同时，筛选土荆芥精油中重要的植物源活性物质，作为农药助剂或者增效剂。田间药效试验是新药剂评价和农药登记的必需步骤，在实验室试验研究的基础上，进行田间药效试验，可为新药剂的开发提供必要的科学依据；而植物精油是植物源杀虫剂天然宝库，如何加快植物精油杀虫产品全面推向市场有待进一步探讨。