circ_0005379通过调控miR-17-5p/酰基辅酶A氧化酶1轴抑制口腔鳞状细胞癌的发展进程

周海霞 王璐瑶 陈帅 王丹丹 方政

郑州大学第一附属医院口腔医学中心，郑州450052

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常见的头颈部肿瘤之一，具有较高的发病率和死亡率。目前，OSCC的治疗取得了较大进步，但患者5年生存率依然较低。研究[1]表明，OSCC细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭在OSCC发生发展过程中起关键作用。因此，深入探讨OSCC发生发展的分子机制，可为该疾病的靶向治疗提供新途径。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类在哺乳动物体内广泛存在的非编码RNA，其可作为微小RNA（microRNA，miRNA）“海绵体”吸附miRNA进而调控靶基因的表达，在肿瘤的发生发展中起重要作用[2]。研究[3-4]已表明，circ_102459、circ_043621和circ_PVT1等多种circRNA参与OSCC的发生发展过程，可作为OSCC治疗的分子靶点。circ_0005379是近年来新发现的一种circRNA，其对OSCC细胞恶性生物学行为的影响及机制还未明确。生物信息学软件预测显示，circ_0005379可能是miR-17-5p的“海绵体”，酰基辅酶A氧化酶1（acyl-CoA oxidase 1，ACOX1）可能是miR-17-5p的靶基因。研究[5]显示，放射线照射可促进OSCC细胞系OC3表达miR-17-5p，抑制miR-17-5p表达增强了OC3细胞的放射敏感性。ACOX1是脂肪细胞内与脂肪酸氧化相关的酶，与肿瘤发生发展密切相关。ACOX1在OSCC组织中表达降低，过表达ACOX1可抑制OSCC细胞的迁移和侵袭能力[6]。miR-17-5p能否靶向调控ACOX1表达影响OSCC细胞的恶性生物学行为也还未知。本研究检测了OSCC组织中circ_0005379、miR-17-5p和ACOX1蛋白表达水平，并以OSCC细胞SCC15为研究对象，miR-17-5p/ACOX1轴为切入点，观察了过表达circ_0005379对OSCC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其调控机制，以期为OSCC的靶向分子治疗提供新途径。

1 材料和方法

1.1 临床资料

选取2017年1月—2018年12月于郑州大学第一附属医院口腔医学中心行手术治疗的51例OSCC患者为研究对象，其中男性29例，女性22例，平均年龄（58.34±7.95）岁。TNM分期Ⅰ和Ⅱ期23例，Ⅲ和Ⅳ期28例；高分化15例，中分化18例，低分化18例；淋巴结转移19例，未转移32例。对应癌旁组织为对照，病理检测未发现癌细胞。所有患者术前未进行放疗、化疗等治疗。研究经医院伦理委员会批准同意，患者或家属自愿签署知情同意书。

1.2 细胞和实验试剂

OSCC细胞系SCC15（中国科学院上海细胞库）；正常口腔黏膜细胞HOK-16A（广州吉妮欧生物科技有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI 1640培养基、四甲基噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、胰蛋白酶、LipofectamineTM2000试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白检测试剂盒、膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；逆转录试剂盒和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）；Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）；鼠抗人ACOX1、上皮性钙黏附蛋白（E-cadherin）、β连环素（β-catenin）、Snail单克隆抗体（Abcam公司，美国）；circ_0005379过表达载体（circ_0005379）、空载体（Vehicle）、miR-17-5p模拟物（mimics）、模拟对照序列（miRNC）（广州锐博生物科技有限公司）；免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；PCR引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 用含10%FBS的RPMI 1640培养基培养SCC15细胞，培养箱环境：37℃、5%CO2、湿度97%。每2～3 d更换1次新鲜培养基。待细胞融合至80%时，吸弃培养基，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例进行传代培养。

1.3.2 实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测基因表达 Trizol试剂提取组织或细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA的纯度和浓度。定量后，参照逆转录试剂盒说明书，将RNA逆转录为cDNA。逆转录总反应体系20μL，反应条件：42℃15 min，95℃3 min。然后以cDNA为模板进行RT-qPCR扩增，反应体系25μL，反应条件：95℃预变性60 s，95℃变性60 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共36次循环。引物序列如下。circ_0005379上游引物序列：5’-GCCCATACCTTTATCCACTC-3’，下游引物序列：5’-GTCAACATTCCAGTCTCTTCCT-3’；miR-17-5p上游引物序列：5’-TGCGGCAAAGTGCTTACAGTG-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：5’-ACATCGCTCAGACACCATGG-3’，下游引物序列：5’-GTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3’；U6上游引物序列：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGG-3’，下游引物序列：5’-CC AGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。circ_0005379以GAPDH为内参，miR-17-5p以U6为内参，2－ΔΔCt法计算circ_0005379、miR-17-5p的相对表达水平。

1.3.3 细胞转染 对数增殖期的SCC15细胞接种于6孔板中，待细胞融合至60%时，更换不含FBS培养基。参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，分别将circ_0005379（circ_0005379组）、Vehicle（Vehicle组）、miR-17-5p mimics（miR-17-5p组）、miR-NC（miR-NC组）、circ_0005379与miR-17-5p（circ_0005379+miR-17-5p组）、circ_0005379与mi-R-NC（circ_0005379+miR-NC组）转染至细胞。转染48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.3.4 MTT检测 细胞增殖转染后的各组细胞以每孔5×103个接种于96孔板中，每组设置3个复孔。培养箱中分别培养24、48和72 h后，每孔加入20μL浓度为5 g·L-1的MTT。继续孵育4 h后，吸弃培养基，加入150μL二甲基亚砜，振荡混匀，于酶标仪490 nm处测定定光密度（optical density，OD）值。实验重复3次，取平均值。

1.3.5 流式细胞术检测细胞凋亡 转染后的各组细胞以每孔2.5×104个接种于24孔板中，每组设置3个复孔。培养48 h后，胰蛋白酶消化，PBS清洗细胞。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书，取1.0×106个细胞，加入500μL结合缓冲液，使用移液器轻轻吹打，混悬细胞。加入10μL Annexin VFITC，涡旋混匀，室温避光反应10 min。加入5μL PI，涡旋混匀，室温避光反应5 min。涡旋混匀后上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.6 Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力 转染后的各组细胞，调整浓度为每毫升5×104个。细胞迁移实验：Transwell上室加入100μL细胞悬液，下室加入500μL含FBS的培养基。培养48 h后，吸弃培养基，取出小室，PBS冲洗2次，棉签擦去上室上层细胞，小室置于4%甲醛中固定30 min。PBS冲洗，置于0.4%结晶紫溶液中染色15 min，PBS清洗至无染料残留。风干后，显微镜观察，随机选取5个视野计数。细胞侵袭实验：Transwell上室铺Matrigel基质胶，自然晾干后加入100μL细胞悬液，后续操作与细胞迁移实验相同。

1.3.7 Western blot法检测细胞中ACOX1、E-cadherin、β-catenin和Snail蛋白表达 细胞培养48 h后，RIPA试剂提取细胞中总蛋白，BCA蛋白试剂盒检测蛋白浓度。蛋白定量后取适量蛋白溶液于EP管中，100℃煮沸5 min，然后以每孔30μg蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，转至聚偏乙烯二氟膜，并置于5%脱脂奶粉中封闭2 h。洗膜后，分别置于ACOX1（1∶500）、Ecadherin（1∶1 000）、β-catenin（1∶500）、Snail（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）抗体孵育液中，4℃孵育过夜。TBST洗膜后，置于加入辣根过氧化酶标记二抗（1∶2 000）孵育液中，37℃孵育1 h。洗膜后，加入电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显影液，避光显影后凝胶成像系统曝光拍照。以GAPDH为内参，Image J软件分析目的蛋白条带灰度值。

1.3.8 双荧光素酶报告基因实验 Starbase生物信息学软件预测显示，miR-17-5p与circ_0005379、ACOX1 3’UTR均存在连续的结合位点。PCR分别扩增circ_0005379、ACOX1与miR-17-5p的结合片段，并克隆至pmirGLO载体上，获得circ_0005379野生型质粒（circ_0005379-WT）及ACOX1野生型质粒（ACOX1-3’UTR-WT）。利用基因突变技术将结合位点突变后，获得circ_0005379突变型质粒（circ_0005379-MUT）及ACOX1突变型质粒（ACOX1-3’UTR-MUT）。然后采用LipofectamineTM2000试剂盒分别将野生型和突变型质粒与miR-17-5p mimics、miR-NC共转染至细胞。转染48 h后，收集细胞。参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明，检测荧光素酶活性，结果以荧光虫活性/海肾荧光强度比值表示各组的荧光素酶活性。

1.3.9 裸鼠移植瘤实验 取对数生长期的SCC15细胞，转染circ_0005379稳定表达的慢病毒载体（circ_0005379组）和携带无义序列的慢病毒载体（Vehicle组），将2组细胞接种至裸鼠后腿皮下。自观察到肉眼可见的肿瘤时，每周用游标卡尺测量瘤体的长径（a）和短径（b），瘤体体积计算公式为：瘤体体积=a×b2/2。5周后，脱颈椎处死裸鼠，剥离肿瘤，PBS清洗后，滤纸吸干水分，称重。RT-qPCR检测肿瘤组织中circ_0005379和miR-17-5p表达水平，Western blot检测肿瘤组织中ACOX1蛋白表达水平，方法同1.3.2和1.3.7。

1.3.10 免疫组织化学染色检测异种移植肿瘤组织中ACOX1蛋白表达 移植瘤标本经4%甲醛固定，常规石蜡包埋后切片（厚度4μm）。常规脱蜡，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后，进行免疫组化染色。高压修复，0.3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，ACOX1一抗浓度为1∶150，4℃过夜。二抗37℃孵育20 min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，复染脱水透明中性树胶封片。结果判断：肿瘤细胞核出现黄色颗粒为ACOX1阳性。

1.4 统计学分析

利用SPSS 22.0软件对实验结果进行分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示。2组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circ_0005379在OSCC组织及细胞中的表达

与癌旁正常组织比较，OSCC组织中circ_0005379表达降低（P＜0.05）（图1左）。与HOK-16A细胞比较，SCC15细胞中circ_0005379表达降低（P＜0.05）（图1右）。

图1 circ_0005379在OSCC组织（左）及细胞系（右）中的表达Fig 1 The expression of circ_0005379 in OSCC tissues(left)and cell lines(right)

2.2 过表达circ_0005379对SCC15细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

与Vehicle组比较，circ_0005379组细胞中circ_0005379表达升高（P＜0.05），表明过表达circ_0005379的SCC15细胞构建成功。与Vehicle组比较，circ_0005379组细胞活性、迁移和侵袭细胞数及β-catenin和Snail蛋白表达降低（P＜0.05），凋亡率和E-cadherin蛋白表达升高（P＜0.05）（图2）。

图2 过表达circ_0005379对SCC15细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响Fig 2 Theeffect of overexpression of circ_0005379 on theproliferation,apoptosis,migration and invasion of SCC15 cells

2.3 circ_0005379靶向结合并调控miR-17-5p表达

Starbase生物信息学软件预测结果显示，circ_0005379与miR-17-5p核苷酸序列存在连续的结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-17-5p与circ_0005379-WT共转染后的SCC15细胞荧光素酶活性降低（P＜0.05），而与circ_0005379-MUT共转染后SCC15细胞荧光素酶活性无显著变化（P＞0.05）（图3A）。与癌旁组织比较，OSCC组织中miR-17-5p表达升高（P＜0.05）（图3B）。与HOK-16A细胞比较，SCC15细胞中miR-17-5p表达升高（P＜0.05）（图3C）。与Vehicle组比较，circ_0005379组细胞中miR-17-5p表达水平降低（P＜0.05）（图3D）。

图3 circ_0005379靶向结合并调控miR-17-5p表达Fig 3 circ_0005379 targets and regulates the expression of miR-17-5p

2.4 过表达miR-17-5p逆转过表达circ_0005379对SCC15细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

与miR-NC组比较，miR-17-5p组SCC15细胞中miR-17-5p表达水平升高（P＜0.05）（图4）。与circ_0005379+miR-NC组比较，circ_0005379+miR-17-5p组SCC15细胞活性、迁移和侵袭细胞数及β-catenin和Snail蛋白表达水平升高（P＜0.05），凋亡率和E-cadherin蛋白表达水平降低（P＜0.05）（图4）。

图4 过表达miR-17-5p逆转过表达circ_0005379对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响Fig 4 Overexpression of miR-17-5p reverses the effect of overexpression of circ_0005379 on the proliferation,apoptosis,migration and invasion of SCC15 cells

2.5 miR-17-5p靶向调控ACOX1表达

Starbase生物信息学软件预测结果显示，miR-17-5p与ACOX1的3’UTR存在连续结合位点（图5A）。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-17-5p与ACOX1-3’UTR-WT共转染后细胞荧光素酶活性降低（P＜0.05），而与ACOX1-3’UTR-MUT共转染后的SCC15细胞荧光素酶活性无显著变化（P＞0.05）（图5B）。与癌旁组织比较，OSCC组织中ACOX1蛋白表达降低（P＜0.05）（图5C）。与HOK-16A细胞比较，SCC15细胞中ACOX1蛋白表达降低（P＜0.05）（图5D）。与miR-NC组比较，miR-17-5p组SCC15细胞中ACOX1蛋白表达降低（P＜0.05）（图5E）。与Vehicle组比较，circ_00053-79组细胞中ACOX1蛋白表达升高（P＜0.05）；与circ_0005379+miR-NC组比较，circ_0005379+miR-17-5p组SCC15细胞中ACOX1蛋白表达降低（P＜0.05）（图5F）。

图5 miR-17-5p靶向并负调控ACOX1表达Fig 5 miR-17-5p targetsand negatively regulatestheexpression of ACOX1

2.6 裸鼠移植瘤实验结果

与Vehicle组比较，circ_0005379组肿瘤体积和重量降低（P＜0.05），肿瘤组织中circ_0005379和ACOX1蛋白表达水平升高（P＜0.05），miR-17-5p表达水平降低（P＜0.05）（图6）。免疫组织化学染色显示，ACOX1在circ_0005379过表达的异种移植肿瘤组织中表达升高（P＜0.05）（图6）。

图6 过表达circ_0005379抑制裸鼠移植瘤生长Fig 6 Overexpression of circ_0005379 inhibits thegrowth of transplanted tumors in nudemice

3 讨论

circRNA呈闭合环状结构，具有高度的保守性和稳定性，在肿瘤等多种疾病中异常表达，有望成为新的诊断及预测肿瘤发生发展的生物标志物[7]。目前，已报道有多种circRNA在OSCC中异常表达，参与OSCC发生发展。Zhu等[8]研究显示，circ_100533在OSCC组织和细胞系中表达降低，其作为miRNA海绵与miR-933结合上调GNAS表达，进而抑制OSCC细胞增殖、迁移，并促进细胞凋亡，可能是OSCC诊断生物标志物和有效治疗靶标。Gao等[9]研究显示，OSCC组织和细胞系中circ_PKD2表达降低，circ_PKD2过表达其作为miR-204-3p的海绵上调腺瘤性息肉病大肠杆菌2（APC2）表达，抑制OSCC细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡和细胞周期停滞，可作为OSCC的新型治疗靶点。circ_0005379是近年来新发现的一种circRNA，其在OSCC中的作用机制还未明确。本研究显示，circ_0005379在OSCC组织和细胞系中表达降低，过表达circ_0005379可降低OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并诱导细胞凋亡，与相关研究[10]结果一致，提示circ_0005379可能作为抑癌基因抑制OSCC的发展进程，是OSCC治疗的潜在靶点。

circRNA可作为竞争性内源RNA（ceRNA）的组成部分，抑制miRNA的活性，从而调控靶基因转录、翻译等功能[11]。生物信息学软件预测显示，circ_0005379可能是miR-17-5p的海绵，通过吸附miR-17-5p调控其表达。研究[12-14]显示，miR-17-5p在结直肠癌、鼻咽癌、多发性骨髓瘤等肿瘤中表达升高，下调其表达可抑制肿瘤细胞的恶性生物学行为。为了进一步探讨过表达circ_0005379发挥抗OSCC作用的机制，本研究通过双荧光素酶报告基因实验和RNA免疫共沉淀实验证实了circ_0005379在OSCC细胞中可与miR-17-5p结合，且过表达circ_0005379后，OSCC细胞中miR-17-5p表达水平降低，说明circ_0005379可吸附miR-17-5p并下调其表达，这也与circ_0005379在OSCC组织和细胞中呈低表达，而miR-17-5p呈高表达的结果一致。本研究还显示，过表达miR-17-5p可逆转过表达circ_0005379对OSCC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及凋亡诱导作用，提示过表达circ_0005379通过下调细胞中miR-17-5p表达来发挥抗OSCC作用。

ACOX1参与脂肪酸氧化，是过氧化物酶体脂肪酸-β氧化第一步脱氢反应的限速酶。研究[15-16]已表明，ACOX1在乳腺癌和胰腺导管腺癌等肿瘤中表达降低，参与肿瘤发生发展。本研究显示，OSCC组织和细胞系中ACOX1呈低表达，提示ACOX1可能作为抑癌基因参与该疾病的发生发展。生物信息学软件预测显示，ACOX1可能是miR-17-5p的靶基因。本研究通过双荧光素酶报告基因实验和RNA免疫共沉淀实验证实了miR-17-5p可与ACOX1靶向结合。此外，过表达miR-17-5p可降低OSCC细胞中ACOX1蛋白表达，证实了miR-17-5p靶向负调控ACOX1表达。本研究还显示，沉默circ_0005379表达可降低OSCC细胞中ACOX1蛋白表达，进一步说明circ_0005379通过竞争性吸附miR-17-5p上调ACOX1表达来抑制OSCC细胞恶性生物学行为，发挥抗OSCC作用。通过皮下注射稳定过表达circ_0005379的OSCC细胞建立裸鼠移植瘤模型，结果显示，过表达circ_0005379可抑制裸鼠肿瘤生长，且肿瘤组织中miR-17-5p表达水平降低，而ACOX1蛋白表达水平升高，提示circ_0005379通过吸附miR-17-5p而上调ACOX1表达抑制裸鼠肿瘤生长。

综上所述，circ_0005379在OSCC组织和细胞中呈低表达，其可能通过竞争性吸附miR-17-5p进而促进ACOX1表达来降低OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡及抑制肿瘤生长，其可能是OSCC治疗的分子靶点。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。