二维液相色谱分离制备热毒宁注射液主要成分

朱 靖 博， 王 琳， 丁 燕， 王 振 中， 萧 伟

( 1.大连工业大学 食品学院, 辽宁 大连 116034；2.江苏康缘药业股份有限公司， 江苏 连云港 222001 )

0 引 言

热毒宁注射液由栀子、青蒿和金银花等3种中药组成，具有清热解毒的功效，在临床中多应用于风寒、咳嗽、发烧和上呼吸道感染等治疗[1-2]。热毒宁注射液化学成分复杂，主要包括环烯醚萜类化学物质和有机酸类化学物质[3-4]。栀子苷具有抗氧化、抗炎镇痛、降血糖、抗肿瘤等药效作用[5-6]；绿原酸具有保护心血管、降糖、降脂、抗病毒、抗癌等药理作用[7-8]。断氧化马钱子苷也为热毒宁注射液重点研究化合物，并且多次出现于热毒宁注射液成分测定中[9-10]。3种化合物为热毒宁注射液中的主要成分，含量用于热毒宁注射液质量评价[11-12]。采用传统的分离纯化方法制备3种主要成分[13-14]，存在需要反复上样等制约制备效率的问题；而制备型二维色谱法具有分离能力强、设备简单和上样量大等特点，对于分离纯化复杂中药中的化合物具有制备效率高的优势[15-17]。

本研究利用制备型离线二维色谱对热毒宁注射液进行分离，并对其中主要成分栀子苷、绿原酸和断氧化马钱子苷进行制备，并对该方法的峰容量和正交度进行测定，以期作为分离制备复杂中药化合物的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

热毒宁注射液，江苏康缘药业股份有限公司；栀子苷、绿原酸和断氧化马钱子苷标准对照品，实验室自制，纯度大于98%，且由质谱鉴定结构。色谱级甲醇、乙腈及工业级甲醇，天津大茂化学试剂厂。

Ultimate 3000高效液相色谱仪，配有Ultimate 3000泵、Ultimate 3000自动进样器、Ultimate 3000 PDA检测器；C18分析柱、Xion分析柱(4.6 mm×250 mm，10 μm)，大连博迈科技发展有限公司；动态轴向压缩工业制备柱C18(250 mm×1 000 mm，10 μm)、制备型液相色谱柱C18(50 mm×250 mm，10 μm)、制备型色谱柱，大连博迈科技发展有限公司。制备色谱检测器为UV-230型紫外检测器，大连依利特分析仪器有限公司。

1.2 样品前处理

首先称取0.1 g热毒宁注射液样品，加入体积比4∶6的甲醇-水溶液，配制成20 mg/mL溶液，经过0.45 μm微孔膜过滤，作为分析样品。另取热毒宁注射液样品80 g，加入5%乙腈水溶液，配制成200 mg/mL溶液，经0.45 μm微孔膜过滤，用于一维制备柱分离制备。

1.3 标准对照图谱的建立

精密称取栀子苷、绿原酸以及断氧化马钱子苷标准品各10 mg混合，加入体积比4∶6甲醇-水溶液，配制成20 mg/mL溶液，使用液相色谱测定混合标准品，如图1所示。色谱条件：C18色谱柱，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，洗脱条件见表1条件1，体积流量为1.0 mL/min。

图1 栀子苷、绿原酸和断氧化马钱子苷混合标准品HPLC图

表1 液相色谱梯度条件

1.4 二维色谱分离条件优化

使用高效液相色谱对热毒宁注射液二维分离条件进行优化，以峰容量为参考指标。选用C18色谱柱和Xion色谱柱(4.6 mm×250 mm，10 μm)搭配不同的流动相分析热毒宁注射液样品，并根据色谱图比较各自峰容量以及组合的理论正交度，色谱条件：

C18色谱柱，流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱条件见表1条件1，体积流量0.8 mL/min。

Xion色谱柱，流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱见表1梯度条件2，体积流量为0.8 mL/min。

C18色谱柱，乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱条件见表1条件3，体积流量为0.8 mL/min。

1.5 制备型二维液相色谱分离热毒宁注射液

1.5.1 第一维动态轴向压缩工业制备色谱分离

将选择的分析型液相色谱条件线性放大至二维制备柱中，并按照线性放大公式(1)考察上样量。

(1)

式中：mp为制备柱上样量，g；ma为分析柱上样量，g；lp为制备柱长度，mm；la为分析柱长度，mm；dp为制备柱内径，mm；da为分析柱内径，mm。

动态轴向压缩工业色谱参数：C18色谱柱(250 mm×1 000 mm，10 μm)，流动相为乙腈(A)-水(B)，体积流量500 mL/min，洗脱梯度见表1条件3。

按照公式(1)，质量由20 mg放大至80 g。热毒宁注射液一次性上样，并收集一维制备组分，浓缩称重，进行液相色谱分析。

1.5.2 第一维分离组分液相色谱分析

色谱条件与标准品溶液分析条件相同，通过对比标准品溶液确定3个化合物的组分。

1.5.3 第二维制备型液相色谱分离

为将组分中的目标化合物完全分离，利用高效液相色谱依据分离度公式考察样品在3、6、9、12 mg时的上样量对目标化合物分离度的影响。利用公式(1)将上样量放大至制备色谱中。

R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)

(2)

式(2)中：R为分离度，tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间，min；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间，min；W1、W2为此相邻两峰的峰宽。

一维色谱分离的组分经对比标准品溶液后确定目标化合物所在组分，将对应组分进行二维制备型液相色谱制备，制备液相色谱参数：C18色谱柱(50 mm×250 mm，10 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，体积流量100 mL/min，洗脱梯度见表1条件1。

1.6 纯度检测

使用高效液相色谱对二维制备分离所得化合物进行纯度检测，所用色谱条件与标准品溶液色谱条件相同。C18色谱柱，乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱条件见表1梯度条件1，体积流量为1.0 mL/min。

1.7 制备型离线二维液相色谱峰容量评价

根据文献[18]的方法，利用在离线二维液相色谱制备分离过程中获得的色谱信息，对第一维色谱柱和第二维色谱柱和整体离线二维色谱体系进行峰容量和正交度评价。以评估制备型离线二维液相色谱对热毒宁注射液的理论分离能力，以及上样量和分离时间等因素对分离能力的影响。

1.8 制备型离线二维液相色谱正交度评价

根据文献[19]的方法，利用二维色谱分离过程的色谱峰保留时间，进行二维色谱的正交度评价。使用Z+、Z-、Z1、Z24条直线构建分离空间，其中Z+、Z-为两条交叉的斜线，Z1、Z2分别为一条垂直线和一条水平线。二维色谱分离的正交度由这4个参数决定，而这些参数由分离过程中的色谱峰保留时间决定。

2 结果与讨论

2.1 二维色谱分离条件的选择

热毒宁注射液3个色谱条件的分离色谱图如图2所示。整理3个色谱图中的色谱峰保留时间和峰宽，峰容量结果如表2所示。

(a) C18乙腈(A)-水(B)

表2 3种分离方法的分离参数及性能

由图2可以看出，由于C18填料与Xion填料分离机理不同，色谱峰出峰顺序不同，而C18分离的出峰顺序大致相同。以乙腈-水为流动相经C18分离热毒宁注射液的理论峰容量为67，Xion的理论峰容量为59，以乙腈-甲酸水经C18分离热毒宁注射液的理论峰容量为132。以乙腈水为流动相的C18和Xion分离在峰容量上并无显著区别；在乙腈-甲酸水的C18分离中加入甲酸改变了流动相的pH，使热毒宁注射液中的酸性化合物和碱性化合物在反相色谱柱中形成不同的保留作用，使原来难以分开的色谱峰得到分离，所以增加了峰容量。

在二维色谱的实际峰容量和正交度计算中，Xion与C18的组合的实际峰容量和正交度均小于C18与C18组合的实际峰容量。因此，选择实际峰容量和正交度相对较高的乙腈-水C18色谱条件和乙腈甲酸水C18色谱条件的二维色谱组合。

2.2 制备型二维液相色谱分离制备结果

2.2.1 第一维动态轴向压缩工业制备色谱分离结果

图3为热毒宁注射液一维分离色谱图。根据色谱峰情况，将热毒宁注射液分为10个组分。其中，各组分质量分别为R1 4.28 g，R2 4.52 g，R3 10.37 g，R4 9.39 g，R5 22.39 g，R6 5.57 g，R7

图3 热毒宁注射液一维制备HPLC图

9.34 g，R8 1.67 g，R9 0.37 g，R10 7.06 g。

2.2.2 第一维制备分离组分分析

利用高效液相色谱对R1～R10组分进行分析，如图4所示。R3、R5、R7组分中含有纯度较高的绿原酸(1)、栀子苷(2)和断氧化马钱子苷(3)，利用第二维制备型液相色谱从中分离出目标化合物。

图4 第一维制备液相色谱10个组分的分离色谱图

2.2.3 第二维制备型液相色谱分离结果

由表3可以看出，对于R3、R5、R7组分的1、2、3号色谱峰，上样量为12 mg时，3个组分中对应化合物的分离度均小于1.50，说明此时的上样量已超过色谱柱最大吸附分配能力。但在上样量为3、6、9 mg时，分离度变化不大。当R<1.00时，两峰有部分重叠；当R=1.00时，两峰基本分离；R≥1.50时完全分离。因此，在R相差不大的情况下选择上样量9 mg为液相色谱条件。根据公式(1)放大至制备型液相色谱中上样量为1 g，并在制备色谱中制备对应组分。

表3 制备型液相色谱上样量

2.3 化合物纯度分析结果

如图5所示，使用对照品溶液的高效液相色谱法对化合物进行纯度检测，化合物1、2、3的纯度均大于98%，且质量分别为2.2、5.9、1.2 g，得率分别为2.8%、7.4%、1.5%(占热毒宁注射液总量)。根据保留时间可以判断二维色谱所分离化合物分别为绿原酸(图5(a))、栀子苷(图5(b))和断氧化马钱子苷(图5(c))。

(a) 绿原酸

2.4 制备型离线二维液相色谱峰容量和正交度评价

通过对二维色谱分离过程中色谱峰信息的采集，计算二维色谱分离热毒宁注射液的峰容量和正交度，如表4所示。本实验中上样量对峰容量的计算基本没有影响，保持在1.000 0左右，说明本实验完全避免上样速度不足或上样量过大的问题；其次，在制备型二维色谱分离过程中，一维色谱制备后的组分进行二维色谱分离制备，使原来谱图中的一个色谱峰分离为几个色谱峰，增加了峰容量。这也是二维色谱峰容量高于一维色谱峰容量的原因。本实验中，C18与C18的二维色谱组合提供了856的色谱峰容量和25%的正交度，具有完全分离绿原酸、栀子苷和断氧化马钱子苷的能力。

表4 制备型离线二维液相色谱峰容量和正交度评价

3 结 论

在热毒宁注射液质量评价中，高纯度的化合物单体对于质量评价和药效作用评价具有至关重要的作用。因此，本实验通过构建制备型离线二维液相色谱，建立可同时分离热毒宁注射液3种有效成分的方法，并可将化合物制备至98%的纯度。同时，在二维色谱分离制备过程中，上样量的考察，确保了第二维制备型液相色谱分离目标化合物的分离度，也提高了整个二维色谱的峰容量。结果证明本实验所用方法较实验室一维色谱分离方法[20]化合物产量高，回收率高，并且由于其良好的峰容量和正交度，具有完全分离出热毒宁注射液中高纯度的栀子苷、绿原酸和断氧化马钱子苷的能力，为热毒宁注射液的质量再评价提供了技术基础。