熟地黄骨胶原钙咀嚼片防治骨质疏松的研究

郭建敏，李云涛*，刘 影，汤 澍，王晓莹，柳婷婷

(1.哈尔滨怡康药业有限公司， 哈尔滨 150060； 2.哈尔滨医科大学 公共卫生学院营养与食品卫生学教研室， 哈尔滨 150081)

骨质疏松是一种全身性的骨骼疾病，其特点是骨质减少，骨组织的细微结构被破坏，使骨的脆性增加，骨折的危险性增加.骨密度是一个判定骨质疏松的指标,它能够反映骨骼的健康状况.骨密度与遗传、饮食、生活习惯等均有关系[1]，随着人口老龄化进程的加速，以骨质疏松症为代表的慢性非传染性疾病成为了社会的常见病、多发病.骨质疏松症的临床终点结局是骨质疏松性骨折，随着发病率的上升，给社会和家庭带来巨大负担[2].我国2013年人口普查结果显示，约有2.02亿人口超60岁，至2050年，可能上升至4亿，其中骨质疏松症的患者将达2.12亿[3].

临床上治疗骨密度降低用化学药物[4]、激素[5]、中成药[6]等手段.近年来发现部分原料用在保健食品中来增加骨密度，如钙制剂、氨基葡萄糖等[7].对于补钙有益的研究发现钙离子对于成骨细胞的分化与增值有部分的促进作用[8].氨基葡萄糖目前的生产工艺以及使用情况，德国联邦风险评估研究所、欧洲食品安全局、新加坡等部门在对此原料使用中，建议葡萄糖代谢受损人群，特别是糖尿病人群等需要谨慎使用[9-11].骨骼健康需要钙、维生素D[12]等营养素.熟地黄骨胶原钙咀嚼片是以碳酸钙、骨胶原、熟地黄、维生素D3、山药为主要原料，经过胃溶型药用薄膜包衣制得的用于增加骨密度的功能性保健食品.

中医认为，骨质疏松症是由肝血虚和肾气虚导致的并发症[13]，故补肾补血是中医治疗骨质疏松症的主要方法.本品是以现代化的制剂技术，经提取、过筛、混合、制粒、压片、包衣等工艺制备而成，功效成分稳定可控，安全性、稳定性等均通过了国家相关技术评价.

1 实验材料与方法

1.1 样品

熟地黄骨胶原钙咀嚼片由哈尔滨怡康药业有限公司提供，样品为棕色粉末.该样品推荐剂量为每次2片，每日2次，每片0.75 g，每人每日3 g.样品每100 g含钙20.0 g.

金钙尔奇牌碳酸钙维D3元素片(4)由惠氏制药有限公司生产，推荐剂量为每次1片，每日1次，每片1.5 g，每人每日1.5 g.样品每1.5 g含钙600 mg，金钙尔奇牌碳酸钙维D3元素片(4)每100 g含钙40.0 g.

1.2 剂量设计

熟地黄骨胶原钙咀嚼片人体推荐剂量为3 g/人/d，如成人体重以60 kg计，则每日推荐剂量为0.05 g/kg·bw.实验设低、中、高三个剂量组，剂量分别为0.25、0.5、1.5 g/kg·bw，含钙量分别为0.05、0.1、0.3 g/kg ·bw.相当于人体推荐剂量的5、10、30倍.金钙尔奇牌碳酸钙维D3元素片(4)人体推荐剂量为1.5g/人/d，如成人体重以60 kg计，则每日推荐剂量为0.025 g/kg·bw.实验设低、中两个剂量组，剂量分别为0.125、0.25 g/kg·bw，含钙量分别为 0.05、0.1 g/kg·bw.相当于人体推荐剂量的5、10倍.另设一个低钙对照组(含钙量为150 mg/100g饲料)(灌胃等容积去离子水)和一个碳酸钙对照组(剂量为0.75 g/kg·bw，碳酸钙中钙的质量占40%，因此含钙量为0.3 g/kg·bw).

1.3 实验动物及分组

SPF级SD品系雄性大鼠70只，体重60～75 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，在清洁级动物实验中心(屏障环境)饲养，动物房温度21～23 ℃，相对湿度55%～58%.动物实验期间均给予低钙饲料，饲料：北京科澳协力饲料有限公司.低钙饲料配方(100 g)含小麦粉54.0 g，黄豆粉15.0 g，酪蛋白10.0 g，淀粉11.0 g，花生油4.0 g，AIN-76混合盐2.6 g，纤维素2.0 g， AIN-76混合维生素1.0 g，氯化胆碱0.2 g，DL-蛋氨酸0.2 g.加入一定质量的CaCO3，使饲料含钙量达到150 mg/100 g，实测含钙量为149.5 mg/100 g.保证有充足饮水，饮用去离子水，连续3个月.

70只大鼠在实验室条件下检疫1周后，随机分成7组，分别为熟地黄骨胶原钙咀嚼片低、中、高三个剂量组，金钙尔奇牌碳酸钙维D3元素片(4)低、中两个剂量组，一个低钙对照组和一个碳酸钙对照组，每组10只，将各组动物均按10 mL/kg·bw灌胃容积进行灌胃.连续灌胃3个月后进行各项指标检测.

1.4 仪器与试剂

AA 7002型原子吸收分光光度计：北京东西分析仪器有限公司；HOLOGIC Discovery双能X线骨密度仪： 哈尔滨医科大学第二附属医院； 动物天平、电子天平、 加样器、 试管、 离心管、 动物解剖器材、游标卡尺、 代谢鼠笼、 105 ℃烘箱.优级纯碳酸钙、硝酸、高氯酸、氧化镧.钙单元素标准溶液(1 000 μg/mL，北京北化康泰临床试剂有限公司).

1.5 实验方法

1.5.1 体重测定

禁食12 h后，测体重，1次/周.

1.5.2 股骨重量测定

动物喂养3个月安乐处死，剥离出右侧股骨，测股骨长度；置105 ℃烘箱中烘烤8 h，至恒重，冷至室温，称定质量.

1.5.3 股骨骨密度测定

确定股骨中点测量点：通过其中点对股骨全长进行测量，沿横截面划一直线，以此作为股骨中点测量点(截面).确定股骨远心端测量点：在股骨远心端关节凹槽最下缘处确定测量点，经过此点划与上述股骨中点处标记的互相平行的直线，以此作为股骨远心端测量点(截面).骨密度仪经过校准后对股骨中点及股骨远心端的骨密度进行测量.

1.5.4 骨含钙量测定

精密称取烤至恒重的股骨整体，放至干燥清洁的150 mL三角瓶(经盐酸处理)中，加入15～20 mL硝酸+高氯酸(4∶1)混合酸，在电热板上加热消化至冒白烟并透明无色.加数毫升去离子水，煮沸去除剩余的酸.重复2次，定容后，用原子吸收分光光度计测定.

1.5.5 钙吸收实验

给予该样品3周后，将大鼠置代谢笼中进行3 d钙代谢实验，记录3天进食量，收集72 h粪便，测定饲料样品及粪便中的含钙量.饲料均匀混合过20目筛后烘干；鼠粪样品混匀，置80 ℃烘箱中进行烘干，干后放干燥器中冷却.磨细后，精密称量饲料或粪便0.300～1.000 g，经过硝酸和高氯酸混合酸消化后，用原子吸收分光光度计测定饲料及粪便中含钙量，从而计算钙的吸收率.

钙的表观吸收率(%)=(摄入钙-粪钙)/摄入钙×100%.

1.6 统计分析

用SPSS统计软件对实验结果进行分析，结果用“平均值±标准差”来表示.用各组间平均数比较进行方差分析.检验水准α=0.05.

1.7 结果判定

根据原卫生部颁布的《保健食品检验与评价技术规范》，给予受试组的骨含钙量或骨密度显著高于低钙对照组且不低于相应剂量碳酸钙对照组，钙的吸收率不低于碳酸钙对照组，可断定该受试组拥有增加骨密度的功效.

2 实验结果

2.1 大鼠体重、钙吸收率的影响

大鼠体重的影响见表1.实验末，熟地黄骨胶原钙咀嚼片高、中剂量组、碳酸钙对照组与金钙尔奇牌碳酸钙维D3元素片(4)中剂量组的体重显著大于低钙对照组.熟地黄骨胶原钙咀嚼片高剂量组的体重与碳酸钙对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05).熟地黄骨胶原钙咀嚼片中剂量组的体重与金钙尔奇牌碳酸钙维D3元素片(4)中剂量组相比，差异无统计学意义(P>0.05).

表1 大鼠体重的影响Table 1 Effect of body weight on

大鼠钙吸收率的影响见表2.实验末，熟地黄骨胶原钙咀嚼片高剂量组的钙吸收率不低于碳酸钙对照组.熟地黄骨胶原钙咀嚼片中剂量组的钙吸收率与金钙尔奇牌碳酸钙维D3元素片(4)中剂量组相比，差异无统计学意义(P> 0.05).

表2 大鼠钙的表观吸收率的影响Table 2 Effect of calcium on apparent absorption

2.2 大鼠股骨质量和长度的影响

大鼠股骨质量和长度的影响见表3.实验末，各剂量组、碳酸钙对照组的股骨质量均显著大于低钙对照组(P<0.01).熟地黄骨胶原钙咀嚼片高剂量组的股骨质量和骨长与碳酸钙对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05).熟地黄骨胶原钙咀嚼片中剂量组的股骨质量与金钙尔奇牌碳酸钙维D3元素片(4)中剂量组比较时，差异无统计学意义(P>0.05).

表3 大鼠股骨质量和长度的影响Table 3 Effect of the weight and length of femur in

2.3 大鼠股骨骨密度和骨含钙量的影响

大鼠股骨骨密度和骨含钙量的影响见表4，5.实验末，熟地黄骨胶原钙咀嚼片高剂量组的股骨密度和和骨含钙量均显著大于低钙剂量组(P<0.05).熟地黄骨胶原钙咀嚼片中剂量组的股骨密度和和骨含钙量与金钙尔奇牌碳酸钙维D3元素片(4)中剂量组相比时，差异无统计学意义(P>0.05).

表4 大鼠股骨骨密度的影响Table 4 Effect of bone mineral density of femur in

表5 大鼠股骨骨含钙量的影响Table 5 Effect of calcium content in femur of

3 讨 论

经口给予大鼠不同剂量的熟地黄骨胶原钙咀嚼片和金钙尔奇牌碳酸钙维D3元素片(4)90 d，相同组别的两个样本大鼠的股骨骨密度、骨含钙量、钙吸收率均无显著性差异，结果显示熟地黄骨胶原钙咀嚼片对大鼠骨密度的作用与金钙尔奇牌碳酸钙维D3元素片(4)无显著性差异.本品质量控制的标志性成分为钙、蛋白质、毛蕊花糖苷[14]、维生素D3.奶制品中具有矿物质及维生素如钙与维生素D等，是老年人和绝经后女性必须的营养物质，有利于延缓骨密度下降[15].