网络药理学探究败酱草治疗溃疡性结肠炎机制

聂承冬，温 静，周婉梅，徐蓓蕾，杨 波，侯兵乔，王淇漩，阎新佳*

(1. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076；2. 黑龙江省预防与治疗老年病药物研究重点实验室，哈尔滨 150076)

败酱草(PatriniavilloseJuss.，或者Patriniascabiosaefolia Fisch.ex Link)具有排脓消痈和清热解毒等功效[1-2].现代临床上，多用于溃疡性结肠炎、胃炎、直肠炎的治疗等，其中尤为溃疡性结肠炎治疗效果显著[3-4].败酱草在治疗溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，下文简称UC)的大量数据表明，其在临床使用、体外实验和体内实验等都具有显著的疗效[5-7].

本文以网络药理学和分子对接工具为基础[8]，探讨败酱草疗法UC作用机制和药效物质基础.由于近几年网络学的流行，可使用工具也愈来越复杂，各不相同.算法的不同，来源的差距也很大，故本文对获得成分靶点的多种工具作了对比，希望研究人员可以针对这些工具来进行反复的研究.

1 材料和方法

1.1 败酱草成分筛选

基于TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[9]，SymMap(https://www.symmap.org/)[10]，TCMID(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)，TCM@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/ index.php)[11]对败酱草的成分筛选，得到败酱草的主要成分.

1.2 败酱草靶点获取

基于已有数据库文本挖掘成分靶点，利用TCMSP，SymMap，TCM@Taiwan CancerHSP(http://tcmspw.com/CancerHSP.php)和PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)数据库获取作用靶点；基于常见成分靶点预测工具(PharmMapper，Swiss Target Prediction，TargetNet，SITCH)获取成分靶点.

PharmMapper[12-14](http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)筛选物种为Homo sapiens，其余默认；Swiss Target Prediction[15](http://www.swiss target prediction.ch/)选择species为Homo sapiens，Prob > 0.095，其余默认；Target Net[16-17](http://targetnet.scbdd.com /calcnet/index/)选择species为Homo sapiens，Include models with:AUC >= 7，Fingerprint type:ECFP4 fingerprints，Prob > 0.095，其余默认；SITCH[18](http://stitch.embl.de/)选择species为Homo sapiens，minimum required interaction score：high confidence (0.700)，其余默认.再通过Uniprot(https://www.uniprot.org)进行信息校正，保留species为“homo sapiens”的靶点，得到败酱草主要成分靶点.

1.3 疾病成分靶点的筛选

以“ulcerative colitis”为关键词，在DrugBank(https://www.drugbank.ca/)[19]，TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[20]，DisGeNET(https://www.disgenet.org/)[21]，MalaCards(https://www.malacards.org/)[22]，GeneCards(https://www.genecards.org/)[23]，OMIM[24](https://omim.org/)中检索UC靶点，再通过Uniprot数据库进行靶点信息校正和去重.

1.4 主要成分-靶点网络的构建

将UC靶点和主要成分分别引入Cytoscape (3.7.2)，组建网络(“成分-作用靶点”).通过“自由度(free degree)”筛选出败酱草治疗UC的主要成分.

1.5 蛋白相互作用构建和富集分析

将败酱草主要成分靶点基因和治疗UC靶点基因通过string平台[25]得到蛋白相互作用数据，导入Cytoscape，构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI).取二者PPI交集，得到核心基因靶点.DAVID 6.8数据库[26-27]对败酱草治疗UC核心靶点进行GO和KEGG富集分析.

1.6 分子对接模拟

将处理好的主要活性成分(配体分子)和蛋白(作用靶点)导入PyRx软件，并对原配体进行分子对接，进行对照，打分系统使用Predicted binding Affinity[28]，并用通过PyMOL2.1.1展现其作用方式.

2 实验结果

2.1 主要成分的筛选

以OB≥30%，DL≥0.18筛选条件经过TCMSP、SymMap、TCMID和TCM@Taiwan数据库检索后，以及文献文本挖掘败酱草所含的抗炎类化合物.经过筛选一共得到40个成分，见表1.

表1 败酱草中主要成分Table 1 Main compounds in Patrinia

MOL000449Stigmasterol43.82990.765280794MOL000498Isoorientin23.29540.7649852298MOL000511UrsolicAcid16.77490.7549867942MOL000764Magnoflorine26.68760.556451920MOL000794Menisperine26.16680.59161487MOL000875Cedro16.23450.1265575MOL001254(-)-Perillaldehyde39.00410.032724159MOL001675Villosol99.29790.0811074397MOL001676VilmorrianineC33.96330.2220055981MOL001677Asperglaucide58.01630.5213855373MOL001678BolusantholB39.94390.4110594416MOL001680Loganin5.901130.4487691MOL001682Morroniside13.86370.5011228693MOL001689Acacetin34.97360.2425202697MOL001694PerillylAlcohol46.23920.03369312MOL001697Sinoacutine63.38840.53821366MOL001790Linarin39.84370.715317025MOL001965Dauricine23.65000.3745358120MOL002322Isovitexin31.29460.7244257794MOL002343Tetrandrine26.63970.1053399220MOL0045644'-Methylkaempferol73.41000.275281666MOL007979Avicularin2.06000.7049766656MOL012914Dauricinoline2.41510.405316319MOL012917Daurinoline2.41510.405316322MOL012920Sinomenine30.98000.4657339442MOL012921Stepharine31.54790.33830726

2.2 核心成分和核心靶点的筛选

经过DrugBank、TTD、DisGeNE、MalaCards、GeneCards、OMIM数据库检索，核查，去重，最终确认了疾病基因靶点共205个.通过数据库文本挖掘(TCMSP，SymMap，TCM@Taiwan CancerHSP和PubChem)、PharmMapper、SwissTargetPrediction、TargetNet、SITCH，共5种获取成分靶点工具，得到5份成分靶点核心成分和核心靶点数据，见表2(仅列出大于等于degree的成分).

表2 败酱草的成分和靶点对比表Table 2 Comparison Tablele of the compounds and targets of Patrinia

对每份数据进行拓扑学结构分析，筛选出大于degree值的成分列出；通过string平台得到败酱草成分靶点和疾病靶点的蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)，对这两个PPI网络进行交集，得到核心靶点，见图1.

图1 败酱草核心靶点对比Figure 1 Comparison of the core targets of Patrinia

2.3 GO富集分析和KEGG通路分析对比

分别对“2”得到的5组败酱草治疗UC核心靶点数据进行了GO和KEGG富集分析，对分析的前10条结果进行可视化，见图2、3.通过图2、3，可以明显看出不同的靶点来源工具得到生物功能和信号通路的排名差异性很大.五种工具在生物功能方面较为相似，只是排名顺序不同，在MF中，受体结合和蛋白质结合等的富集排名靠前；在CC中，细胞质部分、细胞膜、质膜部分等富集排名靠前；在BP中，细胞对刺激的反应、代谢、生物调节等富集排名靠前.值得说的是，在CC中，仅Pharm Mapper和Target Net在排名前10出现了囊泡，其他大致相同.KEGG分析中，五种工具出现与UC相关的，有Inflammatory bowel disease(炎症性肠病)信号通路等.其中，重点对比Inflammatory bowel disease信号通路[29]和JAK-STAT信号通路[30]两个通路(与UC的通路相关)，见表3，可以明显看出数据库文本挖掘得到的有效数据最多；其他工具得到的有效数据也有，但相对较少.

图2 败酱草中治疗UC靶点GO富集分析结果图Figure 2 GO Enrichment Analysis of UC target in Patrinia

图3 败酱草主要靶点KEGG富集通路气泡图Figure 3 Bubble map of enrichment pathways of the main targets in Patrinia

表3 UC相关通路的对比Table 3 Comparison of UC related pathways

2.4 分子对接模拟

由上文可知，数据库文本挖掘得到的数据最接近真实数据，故对其进行分子对接模拟，初步验证其结合活性.选择网络节点度值degree大于等于Median值的15个潜在活性成分和18个潜在活性靶点进行分子对接[31-32].结果只保留打分值最小的.数据经过热图分析，得到图4.打分值大于等于原配体的活性成分占85.2%，说明败酱草活性成分与有效靶点具有较好结合活性，其中Oleanolic acid、Ursolic acid、Stigmasterol、Menisperine、Tetrandrine与靶点IL10、IL1B、IL4、NFKB1、TLR2结合活性非常好.

图4 分子对接分数的热图分析Figure 4 Heat maps of molecular docking scores

Ursolic acid、Oleanolic acid、Stigmasterol是败酱草中常见的三萜类化学成分，且与各蛋白靶点能很好地结合.IL1B、IL4、IL10是常见的炎症因子，可能与治疗UC有关.其中，Oleanolic acid与IL1B对接打分绝对值(-7.4)较原配体打分绝对值(-3.2)更高，通过图5得知，Oleanolic acid端基羟基不仅与IL1B以氢键稳定结合(LYS-56、GLU-64)，端基羟基还被IL1B的疏水loop区(VAL-3、LEU-62、LEU-67)稳定包裹住，但另一端羧基并无与IL1B有结合，说明Oleanolic acid很可能是通过蛋白靶点与含有羟基部分结合，从而产生结合活性；Ursolic acid的结合活性也很好，尤其与IL4打分绝对值(-7.3)相对较高，大于原配体打分绝对值(-3.4).IL4分别与Ursolic acid的两端羟基以氢键(THR-44、ARG-115)连接，Ursolic acid中间碳环稳定嵌入IL4疏水loop区(ILE-119、ILE32、PHE-33、ALA-35)，通过图5中surface模式下对比，可以明显看出与Oleanolic acid相比可能结合更稳定；Stigmasterol则与IL10结合活性较好，其对接打分绝对值(-8.9)大于原配体打分绝对值(-3.3)，主要通过IL10疏水loop区(PHE-30、LEU-26、LEU-94、LEU-98、VAL-33、MET-77、PHE-37、ALA-80、VAL-76)结合产生活性，由于疏水区残基数量超出以上两者很多，故其结合活性可能高于以上两者.

图5 活性蛋白质和活性化合物相互作用分析Figure 5 The analysis of the interaction between active proteins and active compounds

Tetrandrine，Menisperine为败酱草含有生物碱类化学成分，与各蛋白靶点结合活性较好，生物碱类化学成分本身就可能具有多种抗炎活性.NFKB1和TLR2与机体免疫相关的靶点，可能也与治疗UC有关.Tetrandrine与NFKB1结合较好(二者对接打分值：-7.5).Tetrandrine被NFKB1的三个疏水loop区(ILE-123；ILE-163、GLY-185和GLY-184；PHE-228与GLY-226)稳定嵌合，Tetrandrine的两个苯环NFKB1形成两个盐桥(ARG-164、LYS-95)结合； Menisperine和TLR2结合较好(二者对接打分值：-7.3).Menisperine与TLR2三个疏水loop区(MET-766和LEU-737；LEU-658；ALA-652)牢牢嵌合，Menisperine通过苯环与TLR2氨基酸残基形成一个盐桥(TRP-654)结合， Menisperine还通过端基羟基与TLR2形成氢键(TRP-764、ARG-771)，通过图5对Menisperine和Tetrandrine进行相比，发现两者结合牢固程度相似，打分值相近，说明两者其实际结合活性可能也相似.

3 结 语

本文通过网络药理学探究败酱草治疗UC的复杂机制[33].首先，从败酱草中筛选出40个败酱草主要成分及其靶点与UC靶点.本研究对获取成分靶点来源进行了对比，使用了5种常用获取成分靶点网络药理学工具.数据库文本挖掘，是常用的成分靶点收集方法，通过本方法得到的败酱草治疗UC的数据最多，其中黄酮类得到的靶点最多，可能是由于黄酮类的研究较多，其实际作用有待商榷，但通过数据文本挖掘得到的数据更接近真实数值，如果可以进行体内外实验验证，建议使用本方法获取靶点；Pharm Mapper，是将化合物的药效团与药效团模型数据库进行匹配来执行预测.本文中是很接近接近数据库文本挖掘数据的，数据较为准确，对于组方成分较少，数据库挖掘不到成分相关靶点，以及组方中仅有单个成分，建议使用本方法，而且此工具可能会挖掘出其他工具挖掘不出的药物潜在机制；Swiss Target Prediction，是基于2D和3D相似性测量与已知化合物的配对来预测化合物目标的网络服务器，本文中是最接近数据库文本挖掘数据的，数据比较接近真实数值，且预测时间很短，是获取成分靶点较好的工具；Target Net，是基于QSAR(定量结构活性关系)模型预测化合物的目标，预测使用了一种名为朴素贝叶斯分类器的机器学习方法.预测的数据比较准确，其拥有多种分子指纹构建预测模型(FP2、Daylight-Like、MACCS、Estate、ECFP2、ECPF4和ECFP6等)，在本工具预测时，其参数设置较为考究.如果中药组方成分较多，建议使用本工具，还预测出中药组方存在的潜在作用机制；SITCH(相互作用化学品的搜索工具)是一个化学物质和蛋白质之间通过相互作用来预测靶点的数据库，这些相互作用来自高通量实验、其他初级数据库、文本挖掘和计算预测等.本实验中得到数据较少，无法对其评价，但其得到的数据是比较准确的，如果中药组方成分非常多，建议使用本工具.

数据文本挖掘得到的数据最接近真实数值，故只对数据文本挖掘进行讨论.首先从败酱草中筛选出主要成分与UC的靶点，确认Quercetin、Apigenin、Kaempferol、Luteolin、Ursolic acid等共15个核心成分，确定STAT3、TNF、IL6、IL1B和IL10等共18个核心靶点，最后发现Inflammatory bowel disease与JAK-STAT signaling pathway信号通路与败酱草治疗UC作用密切相关，分子对接中，其结合活性良好.

IL10、IL1B、IL4是常见的炎症因子，UC大鼠模型和人类UC患者中发现三者会发生明显的上调，而且这三者还都参与了Inflammatory bowel disease信号通路，引发多种肠道炎症[34-37]；NFKB1主要参与免疫缺陷等过程，TLR2通过调控信号转导来刺激炎症介质(比如IL10、IL1B、IL4等)的释放，并且它们都参与了Inflammatory bowel disease信号通路，在人类UC患者中都有明显的上调浮动[38].Oleanolic acid[39]和Ursolic acid[40]为天然三萜类中具有抗炎和抗癌作用的化合物，以Oleanolic acid和Ursolic acid能作为IL1B抑制剂[41]，抑制炎症发生.Oleanolic acid和Ursolic acid可能通过与IL1B等炎症因子结合，从而抑制其表达，从而达到治疗UC的作用.同为三萜类成分的Stigmasterol不仅能抑制IL1B[42]还能抑制TLR2[43]的表达，从而对UC产生疗效.生物碱类成分Menisperine和Tetrandrine[44]都具有良好的抗炎活性，Tetrandrine 作用于炎症因子IL1B、IL4[45]和Toll样受体TLR2[46]产生抗炎作用，从而达到治疗UC目的，Menisperine具体抗炎靶点未知，但很可能与Tetrandrine作用机制类似.

综上所述，败酱草的黄酮类成分，三萜类成分(Oleanolic acid、Ursolic acid、Stigmasterol等)、和生物碱类成分(Menisperine、Tetrandrine等)可能是其主要治疗UC有效成分，他们通过与靶点IL10、IL1B、IL4、NFKB1、TLR2等关键靶点通过氢键作用，疏水作用，盐桥作用等形式结合，作用于炎症性肠病信号通路等信号通路发挥疗效.本研究为败酱草治疗溃疡性结肠炎机制研究提供了理论依据，其预测结果还待进一步的实验验证.