氟比洛芬酯介导MAPK信号通路保护脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障功能的机制研究

2021-08-12 09:31程晶晶程少飞迟晓慧
川北医学院学报 2021年7期
关键词:阳性细胞脑缺血脑组织

程晶晶,程少飞,迟晓慧

(邯郸市中心医院麻醉科,河北 邯郸 056000)

缺血性脑血管疾病在临床上具有发病率高、致残率高和死亡率高等特点[1]。脑缺血在一定时间内恢复血液供应后,如不采取积极的进一步治疗,会出现更严重的神经功能障碍,即为脑缺血再灌注损伤[2]。寻找疗效明确的治疗缺血性脑血管疾病的药物以及机制探讨一直是临床研究的热点。氟比洛芬酯是一种非甾体类靶向镇痛消炎药,国外研究[3]发现,氟比洛芬酯有一定的抗脑缺血再灌注损伤、保护血脑屏障的作用,但作用机制尚未明确。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者,MAPK信号通路在基因表达调控中发挥关键作用[4]。研究发现[5-6],MAPK信号通路为参与血脑屏障保护作用的重要通路,p38 MAPK是MAPKs的亚类之一,是此通路的关键蛋白。本研究旨在探讨氟比洛芬酯对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障功能的影响,分析氟比洛芬酯介导磷酸化p38 MAPK信号通路保护血脑屏障功能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠72只,体重280~320 g,由邯郸市中心医院实验动物中心提供,并获实验伦理委员会审批通过。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注损伤组(IR组)和氟比洛芬酯组(F组),每组各24只大鼠。氟比洛芬酯注射液购于北京泰德制药股份有限公司;磷酸化p38 MAPK单克隆抗体试剂盒购于上海信裕生物科技有限公司;伊文思蓝(EB)溶液由美国Sigma公司生产;澳美耐OMNI Sonic Ruptor 4000超声波细胞破碎仪由美国OMNI公司生产;DR6000 紫外-可见光分光光度计由美国HACH公司生产。

1.2 方法

1.2.1 脑缺血再灌注大鼠模型制作 F组和IR组大鼠采用改良Koizumi线栓法建立脑缺血再灌注经典模型[7],具体步骤为:腹腔注射10%水合氯醛100 mg进行麻醉,起效后,切开大鼠颈正中皮肤,暴露颈部血管,4-0尼龙线头端制作成鼓槌状。分离左侧颈总动脉、颈外动脉,并从分叉处插入尼龙线至颈内动脉,深度约17 mm,并保持有一定阻力,以阻断大脑中动脉起始端所有的侧支循环血流造成脑缺血。2 h后,将尼龙线抽出,恢复大脑中动脉血供,即再灌注。Sham组只实施麻醉、切开大鼠颈正中皮肤、分离血管但不结扎大脑中动脉。

1.2.2 给药方法 再灌注即刻给药,F组大鼠腹腔注射氟比洛芬酯10 mg/kg,Sham组和IR组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。

1.2.3 指标检测 (1)大鼠脑组织含水量检测:再灌注24 h,每组各随机抽取6只大鼠,断头并低温摘取大鼠脑组织,分离左右大脑半球,先称湿重,然后置于烤箱烘干水分后称干重。脑组织含水量百分比=(湿重-干重)/湿重×100%。(2)大鼠血脑屏障通透性检测:再灌注24 h,每组各随机抽取6只大鼠,股静脉注入2%伊文思蓝(EB)溶液2 mL/kg染色。1 h后,1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后打开胸腔,经心脏灌流肝素钠生理盐水,断头并低温摘取大鼠缺血区的脑组织,吸去残余水分,然后每100 mg脑组织加入甲酰胺溶液1 mL,60 ℃水浴24 h,1 000 rpm离心5 min,用DR6000 紫外-可见光分光光度计在620 nm波长处测吸光度。作出标准曲线,计算脑组织EB含量。肉眼观察各组大鼠脑组织EB染色形态学大体外观,并于荧光显微镜观察各组大鼠脑组织EB红斑分布。(3)p38 MAPK蛋白表达检测:再灌注24 h,每组各随机抽取6只大鼠,采用免疫组化技术检测p38 MAPK蛋白表达。具体方法为:①组织切片制作。麻醉后打开胸腔,经心脏灌流肝素钠生理盐水,断头并低温摘取大鼠缺血区的脑组织,经过脱水、固定、包埋等步骤制作石蜡切片。取500 mL的抗原修复工作液浸泡组织切片,120 ℃加热煮沸20 min,冷却至室温,取出组织切片用磷酸盐缓冲液冲洗3 min、自来水冲洗3 min。组织切片晾干后滴加10%非免疫羊血清,孵育30 min。②SP法进行免疫组化染色。加入p38 MAPK一抗(p38 MAPK的羊抗鼠单克隆抗体工作液)40 μL,另外选取磷酸盐缓冲液作为一抗的阴性对照,4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗,37 ℃孵育30 min,磷酸盐缓冲液冲洗3次,每次5 min。滴加二氨基联苯胺显色液50 μL,染色时间大约5~10 min,显微镜下观察。③评分标准。由病理中心两名医师独立阅片,采用Bresalier半定量法分两部分评分[8]。显色深浅度评分:0分为不显色,1分为浅黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色;阳性细胞数评分:0分为阳性细胞数<5%,1分为阳性细胞数5%~25%,2分为阳性细胞数26%~50%,3分为阳性细胞数51%~75%,4分为阳性细胞数≥76%。累计得分0~1分为(﹣),2~3分为(+),4~5分为(++),6~7分为(+++)。(4)p38 MAPK蛋白相对表达量检测:再灌注24 h,每组各随机抽取6只大鼠,采用免疫印迹(Western blot)检测p38 MAPK蛋白相对表达量。具体方法为:麻醉后打开胸腔,经心脏灌流肝素钠生理盐水,断头并低温摘取大鼠缺血区的脑组织,每100 mg组织加入蛋白裂解液1 mL,刀片式组织破碎匀浆器1 000~3 000 rpm高速匀浆3次,离心取上清液,调整所有蛋白样本至等浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移到硝酸纤维束薄膜上,封闭,加入p38 MAPK一抗,室温下孵育1 h,洗涤;再加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温下孵育1 h,洗涤。采用HRP-ECL发光法曝光,取出胶片浸入显影液至完全显影,清水冲净晾干。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参照计算p38 MAPK蛋白的相对表达量。免疫印迹重复试验至少3次。蛋白含量根据western blot结果条带的灰度值计算,使用Image J软件,导入western blot条带图片,把图片转化成灰度图片,设置定量参数把Western blot条带图片转换成亮带,选定亮带,点击菜单栏Analyze下拉出现的measurement,弹出选定区域的灰度统计值,重复上述步骤直至所有条带都被测量。在Excel表格录入数据,将目的蛋白的灰度值除以GAPDH内参蛋白的灰度值,得到p38 MAPK蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组脑组织含水量比较

F组的脑组织含水量高于Sham组,但低于IR组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 各组脑组织EB含量比较

F组的脑组织EB含量高于Sham组,但低于IR组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2-图4。

2.3 各组脑组织切片免疫组化法的p38 MAPK蛋白表达比较

F组的脑组织切片p38 MAPK蛋白阳性表达的等级高于Sham组,但低于IR组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图5。

表1 各组脑组织免疫组化法的p38 MAPK蛋白表达比较[n(%)]

2.4 各组脑组织免疫印迹法的p38 MAPK蛋白相对表达量比较

F组的脑组织p38 MAPK蛋白相对表达量高于Sham组,但低于IR组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤的病理机制较为复杂,目前主流学说提出可能与自由基及脂质过氧化、线粒体功能障碍、细胞内钙超载、炎症免疫反应、兴奋性氨基酸毒性、高能磷酸化合物缺乏等有关[9-10]。血脑屏障是维持脑组织内环境稳定的重要屏障,可阻止有害物质由血液进入大脑,其功能受损是脑缺血再灌注损伤的重要表现之一,易引起脑水肿,神经元死亡,加重脑损害。本研究采用大鼠脑缺血再灌注经典模型,缺血2 h,再灌注24 h后测大鼠脑组织含水量及EB含量,结果发现,与Sham组比较,IR组的脑组织含水量明显增高,提示大鼠脑缺血再灌注后发生脑水肿;IR组的EB含量也明显增高,提示大鼠血脑屏障受到破坏,血脑屏障通透性增加,结果与Guo等[11]研究报道相符,说明建模成功。

近年研究[12]发现,p38 MAPK与血脑屏障功能密切相关。在脑缺血病理情况下,脑组织p38 MAPK表达明显增加。本研究采用免疫组化法及免疫印迹法检测p38 MAPK表达量,发现IR组的脑组织p38 MAPK蛋白相对表达量高于Sham组,提示大鼠脑缺血再灌注后p38 MAPK表达上调,与Jiang等[13]研究报道相符。p38 MAPK是MAPK家族成员之一,参与应激压力与炎症细胞因子的激活,p38介导炎症免疫反应与细胞凋亡,因此目前多将p38作为抗炎药物的靶位[14-15]。p38 MAPK信号通路也由三级激酶链组成,表现为逐级磷酸化,包括MKK3、MKK4及MKK6,是p38的特异性蛋白激酶[16]。

本研究进一步探讨了氟比洛芬酯对保护血脑屏障功能的影响及介导MAPK信号通路的机制,结果发现,F组脑组织含水量、脑组织EB含量均低于IR组,提示氟比洛芬酯能降低血脑屏障通透性、减轻脑水肿。此外,F组脑组织p38 MAPK蛋白相对表达量低于IR组,提示氟比洛芬酯减轻大鼠脑缺血再灌注损伤、保护血脑屏障功能的机制可能与抑制MAPK信号通路、下调p38 MAPK表达有关。侯莉莉等[17]对大鼠局灶性脑缺血再灌注模型实施氟比洛芬酯后处理,同样发现缺血区脑组织的p38 MAPK表达下调,并认为氟比洛芬酯降低血脑屏障通透性的机制可能与其抑制p38 MAPK信号通路激活有关。Wu等[18]采取氟比洛芬酯预先给药,脑组织含水量和EB含量均降低,且炎症细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-1(IL-1)水平降低,同样提示其机制可能与抑制炎性反应有关,且MAPK信号通路在其中有重要作用。还有研究[19]发现,脑缺血再灌注经氟比洛芬酯处理后,环氧酶-2(COX-2)及p38 MAPK蛋白表达下调,并认为其机制可能是氟比洛芬酯抑制了p38MAPK信号通路,下调了COX-2表达,从而减轻炎症反应。脑缺血再灌注后,在炎症反应介导下一些炎症细胞因子如TNF-α、IL-1等激活p38 MAPK信号通路,导致内皮细胞、基底膜、星形胶质细胞的细胞膜的脂溶性改变,血脑屏障通透性增加,引起脑水肿和神经元损伤。氟比洛芬酯是一种非甾体类消炎药,通过抑制p38 MAPK信号通路,并进一步抑制COX-2,阻断花生四烯酸转化为前列腺素,减少炎症细胞因子生成,减轻了脑缺血再灌注后的炎症反应以及氧化应激,进而保护神经功能。

综上所述,氟比洛芬酯可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤,保护血脑屏障功能,机制可能与抑制MAPK信号通路、下调p38 MAPK表达有关,可为氟比洛芬酯血脑屏障保护作用的机制研究提供参考。

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