即食鲍鱼特定腐败菌的鉴定及其致腐能力研究

郑瑞生，邹菊琴，金兴珏，李 露，，王丹妮，，苏昆轮，林松丁

（1泉州师范学院 福建省海洋藻类活性物质制备与功能开发重点实验室 福建泉州 362002 2安记食品股份有限公司 福建泉州 362000 3福建正港食品有限公司 福建泉州 362013）

鲍鱼属单壳软体动物，含有丰富的蛋白质，味道鲜美，是中国传统的名贵食材，位居四大海味之首。即食鲍鱼因食用方便，营养美味而深受广大消费者的喜爱。然而，鲍鱼易受环境微生物污染，加工过程杀菌不彻底等因素影响，容易导致即食鲍鱼在贮藏过程发生黑变、恶臭、胀袋、流汁及软化等腐败现象，缩短产品的保质期[1]。有研究认为大多数情况下食品中只有部分微生物参与腐败过程[2]。Dalgaard[3]提出特定腐败菌（Specific spoilage organism，SSO）的概念，在相同地理条件下，同类型水产品中只有一种或几种微生物以腐败菌形式出现，甚至特定腐败菌可能只有1 种[4]，而且随着栖息水域、种类、捕获方式、季节、加工环境和贮藏条件的不同，其特定腐败菌也不同[5]。

即食鲍鱼在贮藏过程中，优势腐败菌降解鲍鱼蛋白质和脂肪等营养物质，产生一些腐败物质，如胺、吲哚、硫醇、有机酸等，导致鲍鱼在感官上发生明显的变化[6]。通过某些生化指标可以有效判断鲍鱼产品的特性。如：挥发性盐基氮（TVB-N）是判断水产品鲜度的重要指标，在酶和细菌的作用下，使蛋白质分解而产生具有挥发性的氨氮等碱性化合物；pH 值的高、低也是评判水产品酸败程度的指标，腐败酸败的水产品pH 值偏低，味道刺鼻；酚类化合物会在多酚氧化酶（PPO）的作用下氧化成醌类化合物，发生黑变现象等[7]。

据本课题组前期研究即食鲍鱼加工过程残留菌的变化结果[8]，筛选合适的培养基、分离出即食鲍鱼特定腐败菌，采用16S rDNA 和细菌生化鉴定试剂盒进行鉴定。然后，将SSO 接种于即食鲍鱼中，研究即食鲍鱼黑变、流汁、软化、酸败、胀袋等腐败成因。进一步验证导致即食鲍鱼腐败的SSO，有针对性地采取控制措施，减缓即食鲍鱼腐败变质，确保食品质量安全。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai），泉州市某水产批发市场。

甘露醇卵黄多黏菌素琼脂基础（MYP）、多黏菌素B、胰酪胨大豆羊血琼脂基础（TSSB）、脱纤维羊血、酪蛋白琼脂、3%H2O2、硫酸锰营养琼脂、0.5%碱性复红、革兰氏染色液试剂盒、蜡样芽孢杆菌生化鉴定试剂盒，北京陆桥技术股份有限公司；Ezup柱式细菌基因组DNA 提取试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

营养琼脂（NA）、营养肉汤（NB）培养基，杭州微生物有限公司；盐酸、氯化钠，天津市光复科技发展有限公司；高氯酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，上海金鹿化工有限公司；领苯二酚，阿拉丁；L-脯氨酸，国药集团化学试剂有限公司。以上化学试剂均为分析纯级。

1.2 设备与仪器

XHF-D 型高速分散器（内切式匀浆机）、15-07 型匀质器，宁波新芝生物科技股份有限公司；SHP-150 型生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司；GHP-9080 型隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；BXM-30R 型立式蒸汽灭菌器、BSD-YX2200 型摇床，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Sup G6R 型Supcre 系列菌落计数/筛选/抑菌圈测量联用仪，杭州迅数科技有限公司；GL-20G-H 型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；UV-120 型紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；STARTER3100 型实验室pH 计，上海奥豪斯仪器有限公司；K9840 型自动凯氏定氮仪，济南海能仪器有限公司；ADCI 系列全自动色差计，北京辰泰克仪器技术有限公司。

1.3 即食鲍鱼加工工艺流程

鲜活鲍鱼→开壳、取肉→清洗、沥干→调味→腌制→高温烘烤→低温冷却→真空包装→成品冷藏。

1.4 特定腐败菌的分离、纯化、鉴定

根据本课题前期DGGE 研究结果，参照GB 4789.14-2014[9]方法，利用MYP 选择性培养基【甘露醇卵黄多黏菌素琼脂基础（MYP）+多黏菌素B+卵黄】对即食鲍鱼特定腐败菌进行分离、纯化，最终形成单一菌落，利用16S rDNA 进行鉴定。

1.4.1 特定腐败菌16S rDNA 鉴定 按“Ezup 柱式细菌基因组DNA 提取试剂盒”操作步骤提取鲍鱼细菌总DNA。通用引物：27F-AGTTTGATCMTG GCTCAG；1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT，长度1 500 bp 左右。PCR 反应体系：0.5 μL Template（基因组DNA 20～50 ng/μL），2.5 μL 10×Buffer（含Mg2+），1 μL dNTP（各2.5 mmol/L），0.2 μL Taq 酶，0.5 μL 27F，0.5 μL 1492R，加 双 蒸H2O 至25 μL，PCR 反应条件：在94 ℃下进行5 min 预变性，随后循环扩增30 个循环（包括94 ℃变性45 s，55℃退火45 s，72 ℃延伸60s），最后在72 ℃下延伸10 min。PCR 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收纯化，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将拼接后的测序结果输入https：//www.ncbi.nlm.nih.gov，利用BLAST 软件，将测定得到的基因序列与Genbank 数据库进行序列比对分析，并进行同源相似性比较。

1.4.2 特定腐败菌的生化鉴定

1）生化鉴定 参照“DBI-07 蜡样芽孢杆菌干制生化鉴定试剂盒”进行操作。

2）溶血试验 挑取纯培养的单个可疑菌落接种于TSSB 琼脂平板上，35 ℃培养24 h。

3）蛋白质毒素晶体检测试验 挑取单个可疑菌落接种于硫酸锰营养琼脂平板上，30 ℃培养3 d，挑取单菌落于载玻片上，干燥，固定。加甲醇作用30 s 后倾去，再通过火焰干燥，滴0.5%碱性复红，放火焰上加热1～2 min，移去火焰。更换染色液，再次加温染色30 s，倾去染液用无菌水冲洗、晾干后镜检。

1.5 特定腐败菌接种于即食鲍鱼的研究

1.5.1 特定腐败菌的接种试验 取即食鲍鱼置于超净台，用紫外杀菌1 h，期间用无菌镊子翻面1次，即为无菌即食鲍鱼。取35 ℃培养18～20 h 的特定腐败菌用NB 稀释至105～106CFU/mL，取1 μL该菌悬液，用无菌注射器注射到（30±5）g 的即食鲍鱼表面，用无菌包装袋包装，放置于35 ℃培养箱中贮藏18 d。每隔3 d 取样进行各项理化指标检测。

1.5.2 pH 值的测定 称取5 g 鲍肉试样（精确至0.01 g），加蒸馏水45 mL，绞碎，摇匀，取悬浮液于50 mL 烧杯中（分置2 杯），用酸度计测定pH 值。1.5.3 TVB-N 的测定 参照《食品中挥发性盐基氮的测定》（GB 5009.228-2016）[10]方法测定。

1.5.4 汁液流失率的测定

汁液流失率（%）=（贮藏前鲍鱼质量－贮藏后鲍鱼质量）/贮藏前鲍鱼质量×100

1.5.5 菌落总数的测定 菌落总数的测定参照GB 4789.2-2016[11]规定的方法进行测定。

1.5.6 PPO 的测定 参考林婷[12]的方法并稍作修改，10 g 鲍鱼加入0.067 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH 7.2 左右）25 mL 进行均质。将滤液8 000 r/min 离心30～40 min。取0.8 mL 的上清液，加入0.5 mol/L 邻苯二酚和L-脯氨酸各0.4 mL，再加入0.067 mol/L 磷酸钠缓冲（pH 7.2）4.4 mL，混匀，于37 ℃水浴10 min，测定530 nm 波长处的OD 值。

1.5.7 亨特白度值的测定 取鲍鱼腹足部位，运用ADCI 系列全自动测色色差计进行白度测定，测9 次取平均值。

1.5.8 感官指标的判断 采用描述性评价法[13]分析即食鲍鱼感官变化，主要判断指标有：组织形态是否富有弹性，有无流汁；色泽富有光泽，是否出现黑变；是否存在固有的烘烤香味，有无酸败或其它异味产生；有无胀袋；汁液流失现象是否严重等。

1.6 数据分析

用Excel 软件绘图和数据处理，用SPSS 评判

显著性差异。

2 结果与分析

2.1 即食鲍鱼特定腐败菌的分离、纯化、鉴定结果

2.1.1 16 S rDNA 鉴定即食鲍鱼特定腐败菌 本课题组前期研究即食鲍鱼加工过程菌群的变化，分析出腐败即食鲍鱼的优势腐败菌。选取最亮的条带，比对出相应的疑似菌株，利用MYP 培养基对即食鲍鱼残留腐败菌进行分离、纯化，提取该腐败菌的DNA，进行PCR 扩增，得到重复性好且稳定、清晰的特异性条带，片段长度在1 500 bp 左右，见图1。

图1 特定腐败菌16S rDNA 的PCR 扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoresis of 16S rDNA amplified products of SSO PCR

PCR 产物经纯化后进行核苷酸序列分析，将获得的有效序列提交到NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），通过Blast 程序与GenBank 数据库中已知序列进行相似性比对。分离到的菌株序列与GenBank 中最接近细菌的同源性达到100%，初步确定该细菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），见表1。

表1 特定腐败菌的鉴定结果Table 1 Identification results of SSO

2.1.2 生化鉴定特定腐败菌 利用DBI-07 生化鉴定试剂盒对SSO 进行生化鉴定，鉴定结果如表2所示。

根据分离纯化出的SSO 进行生化鉴定，由表2可知，动力性、溶菌酶耐性、葡萄糖利用、V-P、硝酸盐还原、明胶液化、柠檬酸盐利用、过氧化氢酶和溶血试验均呈阳性；甘露醇产酸和蛋白质毒素晶体反应均呈阴性；符合GB 4789.14-2014[9]中蜡样芽孢杆菌的生化特征，确定分离出的腐败菌为蜡样芽孢杆菌。

表2 特定腐败菌各项生化鉴定结果判断Table 2 Results of biochemical identification of SSO

2.2 SSO 接种于即食鲍鱼后的理化指标变化

用蜡样芽孢杆菌接种于经灭菌的即食鲍鱼，将接种与未接种的即食鲍鱼放置在37 ℃培养，每隔3 d 检测染菌鲍鱼（接种）及自然腐败鲍鱼（未接种）的各项理化指标，详见表3。

表3 鲍鱼的各项指标比较Table 3 Comparison of various indexes of abalone

2.2.1 pH 值的变化 如表3所示，贮藏期间染菌鲍鱼的pH 值低于自然腐败鲍鱼，差异达到显著水平（P＜0.05）。即食鲍鱼初始pH 值为6.62，贮藏前9 d，染菌和自然腐败鲍鱼的pH 值均呈先下降后上升的趋势，第9 天达到最大值6.27 和6.52。这是由于在蜡样芽孢杆菌的作用下，鲍鱼蛋白分解成含氮化合物，有氨态氮及甲胺、尸胺等，导致pH值上升。随后腐败菌降解糖类化合物、脂肪等进一步分解产生有机酸，如甲酸、乙酸、丙酮酸等，形成酸败气味，导致pH 值下降[14]。

2.2.2 TVB-N 的变化 如表3所示，贮藏期间TVB-N 值基本呈上升趋势，且染菌鲍鱼的TVB-N高于自然腐败鲍鱼，差异达到极显著水平（P＜0.01）。即食鲍鱼初始TVB-N 为9.04 mg/100 g，贮藏第18 天时，自然腐败鲍鱼与染菌鲍鱼分别达到最大值91.84，362.32 mg/100 g，严重超过国家标准值[15]，可见，蜡样芽孢杆菌能分解鲍鱼蛋白产生胺类化合物，甚至是吲哚及硫醇等含氮含硫物质；同时蜡样芽孢杆菌能利用鲍鱼中的糖类物质发生降解，产生有机酸、丙酮酸等化合物，同时产生H2S、CO2等恶臭气味，形成胀袋现象[16]。

2.2.3 汁液流失率的变化 如表3所示，鲍鱼汁液流失率的变化均呈升高趋势，且染菌鲍鱼的汁液流失率高于自然腐败鲍鱼（P＜0.01），主要由于蜡样芽孢杆菌能分泌蛋白酶（胞外酶），分解动物蛋白（明胶）生成小分子物质，出现液化现象，加剧即食鲍鱼汁液流失。

2.2.4 菌落总数的变化 如表3所示，菌落总数呈先上升后下降的趋势。即食鲍鱼的初始菌落为2.04 lg（CFU/g），染菌鲍鱼在第3 天达到最大值6.63 lg（CFU/g）；自然腐败鲍鱼在第6 天达到最大值5.64 lg（CFU/g）。随后逐渐降低，自然腐败鲍鱼下降更为明显，染菌鲍鱼的菌落总数显著高于自然腐败鲍鱼（P＜0.01）。主要由于受密闭包装环境影响，好氧微生物生产被抑制，虽出现下降趋势，但两者均超过国家标准[17]。可见蜡样芽孢杆菌加快了即食鲍鱼的腐败菌的滋生。

2.2.5 PPO 变化情况 如表3所示，贮藏期间PPO 吸光度变化趋势基本一致，呈上升趋势。即食鲍鱼初始PPO 的OD530nm为0.270，贮藏第18 天，染菌鲍鱼达0.732，自然腐败鲍鱼为0.611。且染菌鲍鱼的PPO 活性高于自然腐败鲍鱼（P＜0.01）。由于即食鲍鱼中的酚类化合物会在多酚氧化酶（PPO）的作用下氧化成醌类，形成黑变现象[18-19]，导致PPO 吸光度值一直呈上升趋势。可见，蜡样芽孢杆菌促进即食鲍鱼发生黑变现象。

2.2.6 亨特白度变化情况 贮藏期间，鲍鱼的亨特白度值基本呈上升趋势。自然腐败鲍鱼的亨特白度一直高于染菌鲍鱼，这是由于染菌鲍鱼的PPO 含量较高，促使鲍鱼发生黑变。贮藏时间越长，染菌鲍鱼黑变越显著。

2.2.7 感官指标变化情况 贮藏期间2 种鲍鱼的感官评价均呈下降趋势，染菌鲍鱼的感官指标明显低于自然腐败鲍鱼。染菌鲍鱼在第3 天时就出现明显软化、涨袋、汁液流失现象：贮藏第9 天，染菌鲍鱼出现极其刺鼻的味道，组织软化严重，鲍肉黑变明显。而自然腐败鲍鱼感官变化相对缓慢。由此可见，蜡样芽孢杆菌加剧鲍鱼的腐败变质，尤其是组织形态软化、黑变、流汁现象更为严重。

3 结论

根据DGGE 技术分析结果，利用16S rDNA技术和细菌生化鉴定试剂盒对即食鲍鱼分离出的优势腐败菌进行鉴定，确定即食鲍鱼的SSO 为蜡样芽孢杆菌。通过接种蜡样芽孢杆菌试验，对比天然腐败鲍鱼与染菌鲍鱼的理化指标，结果表明：在贮藏过程中，染菌鲍鱼的pH 值、TVB-N、汁液流失率、菌落总数、亨特白度、PPO 活性等指标均比自然腐败鲍鱼劣化更为严重。结合感官评价，染菌鲍鱼出现明显涨袋、汁液流失及黑变现象，甚至出现极其刺鼻的气味，组织软化严重。而自然腐败鲍鱼感官变化相对缓慢。由此可见，蜡样芽孢杆菌加快即食鲍鱼中蛋白质、碳水化合物、脂肪和酚类化合物等营养物质的分解，产生腐败性物质，缩短了即食鲍鱼的贮藏时间，促使即食鲍鱼产生黑变、恶臭、胀袋、流汁及软化等腐败变质现象。

本研究利用蜡样芽孢杆菌接种于即食鲍鱼，对其致腐能力进行综合分析，进一步验证了蜡样芽孢杆菌作为真空包装即食鲍鱼特定腐败菌的可能性。因此，有必要针对蜡样芽孢杆菌采取有效的控制措施防止其滋生，延长即食鲍鱼的货架期。