功能调和油改善大鼠血压、组织脂肪酸和氧化-还原稳态的研究

杨绍军，刘昌树，王 赛，丛 洋，吕一品，唐 雪*，周 鹏

（1江南大学食品学院 江苏无锡 214122 2佳格食品（中国）有限公司 江苏苏州 215000）

近年来，我国心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）患病率日益增加，已成为严重影响居民健康水平的慢性疾病之一[1]。CVD 是由多种不良因素长期综合作用引起，主要包括遗传、高血压、血脂异常、超重/肥胖和不健康的膳食等[2]。研究发现，由长期高脂膳食引起的肥胖常常伴随机体血脂异常、氧化应激和炎性反应，是CVD 患病风险增加的主要因素[3]，其中膳食脂肪酸组成及其比例具有十分重要的影响[4]。居民日常摄入的植物油脂肪酸成分过于单一，不能满足营养均衡的要求，大量研究证实，过量摄入高比例饱和脂肪酸（Saturated fatty acid，SFA）和含亚油酸（Linoleic acid，LA）的油脂会诱发机体炎症反应、高血脂症及动脉粥样硬化等心血管疾病[5-7]。而α-亚油酸（α-Linolenic acid，ALA）具有抗炎、抗氧化的效果，可通过降低血浆LDL-C 水平，提高HDL-C 水平，减少心血管系统氧化应激反应来降低CVD 患病风险[8-10]。人群调查和动物研究发现，提高膳食油脂ALA 比例，降低LA 比例，可显著改善血压和血脂，维护心血管系统氧化-还原稳态[11-12]。目前没有一种天然的植物油能够满足营养学家所推荐的脂肪酸均衡要求[13]。本研究前期通过混合不同比例的植物油（芥花油、葵花油、玉米油、花生油和橄榄油），优化ALA/LA 比例，研发出一款功能调和油。以大鼠为研究对象，通过比较3 种食用油（猪油、大豆油和功能调和油） 在不同能量水平下对血浆和组织脂肪酸组成、血脂、血压及氧化还原稳态的影响，明确功能调和油对心血管系统的调节作用，为相关产品的研发、优化及市场推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪油和大豆油在当地超市购买，功能调和油为佳格投资有限公司提供（专利申请号201910414467.3）。过氧化氢酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）和总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒，南京建城生物工程研究所。

1.2 主要仪器与设备

5804R 台式高速冷冻离心机，美国Thermo Scientific 公司；R686VLT 型超低温冰箱，美国INVETRO 公司；BioTek Epoch 全波长酶标仪，美国Biotek 公司；Eppendorf 5430R 微量移液枪，德国Eppendorf 公司；M5 型酶标仪，美国Molecular Devices 公司；超净台，苏州仪器四厂；Mettle Toledo AB204-N 电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；BP-98A/B 鼠尾无创血压仪，日本软隆公司。

1.3 实验动物及分组

90 只SPF 级Wistar 雄性大鼠【7 周龄，体重（183.29±11.32）g】，上海斯莱克公司，饲养于江南大学实验动物中心。实验伦理审核编号：JN.No20180315W0900707[39]。采用12 h 光照（8：00-20：00），相对湿度40%～70%，相对温度22 ～26℃，所有试验操作都符合江南大学实验动物福利、实验动物护理和使用指南的指导原则。

预饲养1 周，随机分组为猪油组（Lard oil，LO）、大豆油组（Soybean oil，SO）、功能调和油组（Blended oil，BO），每组分为低、中、高3 个能量水平。低脂组的6.7%能量来源于脂肪，相当于中国居民膳食指南推荐量25 g/d；中脂组的10.9%能量来源于脂肪，相当于中国居民实际摄入量41.4 g/d，高脂组的48.1%能量来源于脂肪，相当于过量摄入200 g/d。

功能调和油由芥花油、葵花油、玉米油、花生油和橄榄油按一定比例调和而成。3 种食用油的脂肪酸组成及比例如表2所示，猪油含42.21%OA（Oleic acid，OA）、13.91% LA、0.6% ALA，ALA/LA比值为1∶24；大豆油含30.80%OA、40.55%LA、4.36%ALA，ALA/LA 比值为1∶9；功能调和油含50.93%OA、31.73%LA、α-亚油酸5.41%ALA，ALA/LA 比值为1∶6。

表1 饲料配方Table 1 Nutrient composition of rat diets

表2 样品油脂肪酸组成（%）Table 2 The fatty acid compositions of the oil samples（%）

（续表2）

1.4 处死动物及生化分析

经过12 周饲喂后，处死前12 h 禁食、不禁水，处死时注射1%的戊巴比妥溶液（0.6 mL/100 g），采用腹主动脉取血法，将血液收集到干净的试管中，在4 ℃下3 000×g 离心10 min 分离出血浆，然后保存在-80 ℃的温度下进行下一步分析。将新鲜肝脏或心脏组织（100 mg）用900 μL PBS 匀浆，将匀浆物以3 000 r/min 离心15 min 后取上清液备用。

1.5 脂肪酸成分分析

1.5.1 总脂肪酸的提取 取肝脏30 mg，加入0.5 mL 生理盐水，0.3 mg 二十一烷酸甲酯（C21：0）内标于离心管中，低温冰水浴内充分匀浆后转移至玻璃管，加入3 mL 预混好的提取试剂甲醇-三氯甲烷（体积比1∶2），漩涡振荡30 s 混匀，室温下振荡1 h，充分提取置于离心机中3 000 r/min 离心10 min，移液器移取下层于新的离心管中，重复提取，合并2 次提取液，氮气吹干。

1.5.2 皂化甲酯化 加2 mL 0.5 mol/L 氢氧化钾-甲醇，65 ℃下振荡30 min 后，加入2 mL 三氟化硼-甲醇（体积比1∶3），70 ℃水浴5 min，依次加入2 mL 正己烷、饱和氯化钠溶液，充分振荡，静置分层，取上层有机相至离心管中，加入无水硫酸钠，10 000 r/min 离心3 min，取上层1.5 mL 左右过0.45 μm 有机滤膜，转移至气相样品瓶中，准备上机进GC 测定分析，根据脂肪酸标品定性，样品所产生的峰面积用归一化法计算脂肪酸相对百分比含量。食用油可直接取200 μL 进行皂化甲酯化，脂肪取30 mg 匀浆后离心，取上清再进行皂化甲酯化。

1.6 血压测量

采用无创尾套法测压，将大鼠置于束缚器中，用40 ℃恒温水浸泡鼠尾30 min，使鼠尾部血管组织充分扩张，擦干鼠尾，将其穿过加压装置并固定在鼠尾根部向下1 cm 处，启动充气按钮，可以检测收缩压（Systolic blood pressure，SBP）、舒 张压（Diastolic blood pressure，DBP）、平 均 压（Mean blood pressure，MBP）、心率（HR）。

1.7 统计学处理

2 结果与分析

2.1 功能调和油对动物体重及脏器指数的影响

如图1所示，低脂日粮饲喂大鼠12 周，LO、SO 和BO 组大鼠体重在各个时间点均无显著性差异（P>0.05）。中脂日粮饲喂4 周、高脂日粮饲喂3 周后，猪油组和大豆油组的体重均显著高于功能调和油组（P<0.05），3 组体重趋势为：LO 组>SO组>BO 组。此外，随着能量水平的提高，各组肝脏和脂肪质量均呈上升趋势，而BO 高脂组的肝脏、脂肪质量显著低于LO 和SO 高脂组（P<0.05），维持了较低的体脂率（P<0.05）（表2）。上述结果表明，与LO 和SO 相比，BO 可有效降低高脂日粮诱导肥胖大鼠的体重及体脂率，缓解肥胖的发生发展。

图1 大鼠体重变化（±s，n=10）Fig.1 Body weight of rats（±s，n=10）

表3 大鼠生长性能和脏器指数Table 3 Growth performance and viscera index of rats

2.2 功能调和油对血脂和血压的影响

如图2所示，随着日粮中油脂供能比例的提高，各组血浆甘油三酯（Triglyceride，TG）、游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA）水平以及收缩压、舒张压和平均压均有一定程度的上升，其中以LO 组最为显著（P<0.05）。在高脂日粮条件下，与LO 组相比，大鼠饲喂BO日粮可显著降低血浆TG 水平，维持较好的收缩压、舒张压和平均压，表明BO 具有调节肥胖大鼠血脂及血压作用。此外，在同一能量水平下，各组血浆总胆固醇（Total cholesterol，TC）和FFA 水平均无显著性差异（P>0.05）。

图2 大鼠血浆生化指标和血压Fig.2 The serum lipid parameters and blood pressure of rats

2.3 血浆及组织脂肪酸组成

如表4所示，对3 种油脂高脂组血浆、肝脏和脂肪组织的脂肪酸组成进行分析发现，随着饲料中α-亚麻酸比例的提高，BO 组血浆、肝脏和脂肪组织中ALA 的比例相较于LO 组具有明显的提高（P<0.05）。在肝脏和脂肪组织，LO 组饱和脂肪酸所占比例显著高于SO 组和BO 组（P<0.05）。通过计算ALA 和LA 的含量以及比值，LO 组、SO组和BO 组血浆ALA/LA 比例依次为1∶41，1∶26，1∶20，肝脏ALA/LA 比例为1∶90.5，1∶29，1∶24，脂肪组织ALA/LA 比例分别为1∶47，1∶21，1∶11。

表4 高脂组大鼠血浆、肝脏和脂肪脂肪酸组成分析Table 4 The fatty acid compositions of plasma，liver and adipose tissue lipids in high fat-fed rats

（续表4）

2.4 血浆和心脏组织氧化还原相关指标

抗氧化防御系统是保护组织免受自由基和活性氧（ROS） 氧化损害并预防慢性疾病的重要屏障。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和过氧化氢酶（CAT）可以抑制和清除ROS，平衡氧化还原稳态。丙二醛（MDA）是衡量脂质过氧化产物的重要指标。如图3所示，随着饲料中脂肪能量占比升高，大鼠饲喂LO日粮使得血浆和心脏总抗氧化能力（T-AOC）和GSH-PX 活性进一步降低，MDA 和ROS 水平提高，引起组织氧化损伤。在高脂日粮条件下，与LO 组相比，SO 组和BO 组的血浆和心脏氧化还原稳态相关指标有一定程度的改善，其中BO 可显著提高血浆TAOC 水平、心脏GSH-PX 活性（P<0.05），降低血ROS 和心脏ROS、MDA 水平（P<0.05）。

图3 血浆和心脏组织氧化还原相关指标Fig.3 Plasma and heart tissue redox related indicators

3 讨论

心血管疾病和膳食油脂摄入有着密不可分的联系。当机体摄入过多的脂肪特别是饱和脂肪酸，会引起血脂代谢异常，血浆TG 水平偏高，肝脏和脂肪组织脂代谢紊乱，最终导致动脉粥样硬化及心血管系统疾病[14]。而不饱和脂肪酸则具有改善高血脂、高胆固醇和胰岛素抵抗的功效。本研究所采用的功能调和油（BO）是由芥花油、葵花油、玉米油、花生油和橄榄油按一定比例调和而成，包含9.1%的SFA、37.13%的PUFA、53.77%的MUFA，其中ALA 和LA 比例为1∶6，α-亚麻酸所占比例明显高于猪油和大豆油。研究结果显示，高比例BO日粮饲喂大鼠12 周后，改变了血浆、肝脏和脂肪组织的脂肪酸组成，使ALA/LA 比例分别达到1∶20，1∶24，1∶11，相较于猪油（LO）组和大豆油（SO）组有显著提高。上述结果表明，提高膳食油脂ALA 含量，可增加血浆和组织ALA 水平。

摄入一定量的不饱和脂肪酸可显著降低肥胖发生率，维持正常血脂水平和血压，其作用机制涉及脂肪的合成与分解、肾素-血管紧张系统等多个方面[15]。本研究结果显示，在中脂和高脂日粮条件下，BO 可显著降低大鼠的体重，抵抗由高脂日粮摄入引起的肝脏质量和体脂比率上升，使肥胖大鼠维持较好的血脂和血压，降低动脉硬化指数。这与Engler 等[16]报道一致。大量动物实验证明，食用高比例的不饱和脂肪酸油会显著降低TG 水平，一方面可能与抑制脂肪酸合成，促进脂肪酸氧化，降低酰基转移酶活性及增强脂肪酸向磷脂的转化能力有关，另一方面可能与增强血脂的分解和清除有关[17]。肾素-血管紧张素系统在ALA 的降压过程中起到一定作用，血管紧张素转换酶（ACE）的活性降低，血管紧张素II 和TGF-β 的表达减少，同时副交感神经系统被eNO 激活[18-19]，自发性高血压大鼠的血压得以降低[20-21]。本研究发现，与LO组和SO 组相比，BO 可显著降低肥胖大鼠的收缩压、舒张压和平均压，这可能与BO 中功能成分降低血脂水平及调节肾素-血管紧张素系统有关。

机体发生氧化应激反应，会生成过量ROS，不但会降低一氧化氮酶的利用率，而且会氧化损伤血管内皮细胞，导致内皮功能障碍和心血管疾病[22-24]。本研究通过测定氧化还原相关指标，发现BO 可显著降低高脂日粮饲喂大鼠的血浆和心脏组织ROS 水平和MDA 含量，在一定程度上提高T-AOC、GSH-PX 和CAT 的抗氧化酶活性。这与之前研究，添加ALA 饲喂的小鼠可降低血脂水平，提高抗氧化能力的结果一致[25]。PUFA 是细胞膜中磷脂膜的主要成分，氧自由基攻击磷脂膜引起脂质过氧化。花生四烯酸（Arochidonic acid，AA）氧化生成8-异前列腺素F2α（8-iso-ProstaglandinF2alpha，8-iso-PGF2α） 会促使单核细胞黏附微血管内皮细胞，导致内皮受损，改变细胞膜流动性，加重机体氧化应激[26-27]。而摄入一定剂量的ALA 会减少细胞膜中AA 的含量，改变细胞膜中脂肪酸的组成，从而减少8-iso-PGF2α 的产生[28-29]。ALA 中大量的不饱和双键会导致体内脂质过氧化，超过机体代谢程度。可见，摄入合适比例的ALA 和LA，对心血管氧化还原系统具有重要影响。

膳食脂肪酸的构成比，尤其是ALA 和AA 的比例，对脂代谢和抗氧化调节的影响不同。对n-3PUFA 和n-6PUFA 的相关研究显示，推荐ALA/LA 比值范围为1∶4～1∶10。ALA 和LA 结构十分相似，可在体内相互转化和代谢，而分子机制尚不清楚。本研究发现，含高饱和脂肪酸的LO，其中ALA和LA 的含量较少，大量摄入后引起大鼠体重增加，血脂血压异常，显著降低了心脏组织抗氧化能力。BO 和SO 的饱和脂肪酸占比较少，虽然含有近似相同水平ALA，但由于SO 含有较多LA，一定程度上限制了ALA 的功效。虽然BO 组和SO组的ALA/LA 比例在推荐范围之内，但相较于SO，BO 具有更好的心血管保护作用，即在高脂膳食模式下，ALA/LA 比例为1∶6 时可明显降低体重、体脂比率，维持正常的血脂血压和氧化还原稳态。

4 结论

本文探究了不同能量水平下功能调和油对大鼠心血管系统的影响。结果表明，与猪油和大豆油相比，长期饲喂功能调和油可更好地降低肥胖大鼠体重、体脂率，增加血浆、肝脏和脂肪组织ALA/LA 比值，通过改善血脂水平和血浆、心脏氧化还原稳态，使大鼠维持了较好的血压状态。本研究结果可为功能调和油的研发、优化及市场推广提供有价值的理论依据。