TERC 与 p16/Ki-67 检测诊断宫颈高级别上皮内瘤变效能比较

刘欣，陈少敏，高冠峰

潍坊市人民医院妇科，山东潍坊261041

在女性肿瘤中，宫颈癌发病率较高，高危人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是导致宫颈癌的直接病因。近年来随着宫颈病变筛查的普及，发病率及病死率有所下降。根据国家癌症中心2019 年全国癌症报告，在女性恶性肿瘤中，宫颈癌的发病占比6.25%，居第六位；病死率占比3.96%，居第八位，均高于子宫内膜癌、卵巢癌等恶性肿瘤。根据美国癌症学会2019 年癌症统计，美国2019 年宫颈癌发病13 170例，死亡4 250例，宫颈癌在20～39岁女性中，病死率居第二位［1］。目前最常用的宫颈细胞学筛查存在主观性强、重复性差、容易产生争议结果的缺点。高危HPV 检测作为宫颈细胞学的补充，主要推荐用于＞30岁的女性人群。但HPV 检测特异度差，且现行检测方法无法准确指出哪部分感染患者更易于发生宫颈癌。大量HPV 感染的妇女行阴道镜检查，造成了不必要的心理和经济负担。原癌基因的扩增，如TERC 的扩增是宫颈癌变的早期事件，诊断效能卓越［2］，但价格较高，从经济—效能比率的因素考虑尚需改进。p16/Ki-67 免疫细胞化学检测近年来逐步被应用于宫颈癌筛查，有较高的灵敏度和特异度，可作为宫颈高级别上皮内瘤变（CIN2+）的有效筛查手段［3］。本研究对比TERC及p16/Ki-67在宫颈细胞学标本中检测的诊断效能，从而选取更优化的筛查策略。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选取2013 年1 月—2020 年12月于潍坊市人民医院门诊就诊的宫颈液基薄层细胞学（TCT）或HPV 筛查阳性患者。纳入标准：妇科门诊就诊病例以及机会性筛查的25～64 岁病例。排除标准：近期接受过宫颈病变治疗的病例；已行阴道镜活检或已确诊宫颈上皮内瘤变（CIN）者。共入组筛查阳性患者51 例，患者年龄（40 ± 6.5）岁。所有病例已行TCT 检查及HPV 检测，并经组织学证实和阴道镜检查。51 例患者中，组织学检查证实正常4例，CIN1 级 12 例，CIN2 级 18 例，CIN3 级 14 例，鳞状细胞癌（SCC）3例。细胞学诊断分布：无上皮内病变或恶性病变（NILM）7 例，非典型鳞状上皮细胞不能明确意义（ASCUS）15 例，低级别鳞状上皮内病变（LSIL）15 例，非典型鳞状细胞倾向高度病变（ASCH）6 例，高级别鳞状上皮内病变（HSIL）8 例。另选取10例TCT及HPV筛查均为阴性的患者作为对照，阴道镜活检病理或子宫全切术后宫颈病理正常。统计分析时，宫颈CIN2+级及以上视为宫颈癌前病变，CIN1-组共计26例（包含炎症及CIN1），CIN2+组（包含CIN2、CIN3 及SCC）共计35 例。本研究开展获医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 TERC 扩增检测 采用荧光原位杂交（FISH）法。双色FISH探针购自北京GP 医疗技术公司。取5 mL 剩余TCT 细胞保存液，离心后胶原酶B 溶液37 ℃消化20 min，去离子水37 ℃水浴静置30 min。甲醇—冰醋酸固定并滴片，56 ℃烤片30 min。滴加探针混合物，75 ℃水浴锅内共变性5 min，42 ℃杂交16 h，67 ℃下 0.3% NP-40/0.4×SSC 溶液中洗涤，70%乙醇洗涤3 min，干燥玻片后滴加4，6-二脒基-2-苯基吲哚，暗处放置10～20 min后，荧光显微镜下观察。FISH 图像用Olympus 荧光显微镜，使用Video-TesT-FISH 2.0 软件采集。信号判读：单个细胞核中观测到2 个红色信号（TERC）和2 个绿色信号（CEP3）认定为正常二倍体细胞。TERC 信号＞2 个，或TERC 信号和CEP 信号比值＞1，则认定为异常细胞。观察计数视野中的所有细胞（＞100 个），对观察细胞中异常细胞占比进行测算。以TERC 扩增细胞≥5%为阳性阈值。

1.3 p16/Ki-67 表达检测 采用细胞免疫化学法。取剩余TCT 标本保存液混匀2 min，吸取2 mL 入沉降制片器，静置10 min。去除上清液，拆除制片器，将玻片稍干，95%乙醇固定10 min。鼠抗人p16 INK4a 蛋白单克隆抗体、兔抗人Ki-67 单克隆抗体、DS-0001 Polymer 双染检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。将玻片在3%H2O2孵育10 min，微波炉抗原修复，封闭液封闭10 min。加入一抗混合物，湿盒孵育。加入辣根酶标记山羊抗小鼠IgG和碱磷酶标记山羊抗兔IgG的二抗聚合物，湿盒孵育30 min。滴加DAB 工作液，镜下观察，约3 min。滴加 AP-Red 工作液，孵育 10 min，镜下观察。苏木素复染，封片观察。p16 阳性显色为细胞核和细胞质的棕黄色，Ki-67 阳性显色为细胞核红色。在同一细胞中出现双染提示为p16/Ki-67 阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。率的比较使用Z检验，四格表资料使用χ2检验。绘制受试者工作特征（ROC）曲线评估 TCT、HPV、TERC、p16、Ki-67 的诊断效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织学类型患者TCT、HPV、TERC、p16、Ki-67 阳性情况比较 TERC 扩增率在CIN1-组和CIN2+组中分别为11.5%及94.3%，差异有统计学意义（P＜0.01）。p16 扩增率在CIN1-组和CIN2+组中分别为42.3%及88.6%，差异有统计学意义（P＜0.01）。Ki-67 扩增率在 CIN1-组和 CIN2+组中分别为15.4%及82.9%，差异有统计学意义（P＜0.01）。p16/Ki-67 双染阳性在CIN1-组和CIN2+组中分别为4.0%及80.0%，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 不同组织学类型患者TCT及HPV结果、TERC扩增、p16及Ki-67表达比较（例）

2.2 TCT、HPV、TERC、p16、Ki-67 对于 CIN2+的诊断效能比较 见表2。TERC 检测较TCT/HPV 检测有较高的灵敏度和特异度（94.3% vs 80.0%，88.5% vs 61.5%，P均＜0.05）。p16/Ki-67 检测较TCT/HPV 检测有相似的灵敏度和较高的特异度（80.0% vs 80.0%，P＞0.05；96.2% vs 61.5%，P＜0.05）。p16/Ki-67 检测具备与 TERC 检测较低的灵敏度（80.0% vs 94.3%，P＜0.05），略高的特异度（96.2% vs 88.5%，P＞0.05），并有相似的准确性（86.9% vs 91.8%，P＞0.05）。在各种诊断策略中，p16/Ki-67 特异度最高（96.2%），其次为 TERC（88.5%）。TERC 灵敏度最高（94.3%），其次为HPV（91.4%）。曲线下面积（AUC）最高的是TERC 检测（AUC=0.927），其 次 为 p16/Ki-67 检 测（AUC=0.903）。

表2 TCT及HPV结果、TERC扩增、p16及Ki-67表达对于CIN2+的诊断效能比较［%（95%CI）］

3 讨论

宫颈癌目前的筛查策略以细胞学和HPV 结合为主，存在一定局限性。细胞学诊断是主观诊断，存在灵敏度差、可重复性差的缺点，对病理学医师的要求较高。HPV 检测作为细胞学的补充，灵敏度高，可以弥补TCT 不足，但大量HPV 阳性结果增加了阴道镜转诊量，造成不必要的心理负担和经济花费［4］。美国阴道镜及宫颈病理学会（ASCCP）指南建议对30 岁以上女性可实施细胞学和HPV 联合筛查。2018年美国预防服务工作小组（USPSTF）建议指出，30～65 岁的妇女应与其医疗保健专业人员讨论哪种检测策略最适合，表明在选择特定策略时，偏好可能是重要的考虑因素。USPSTF 将单独选择HPV 检测或联合测试对细胞学策略的临床意义总结如下：基于HPV 筛查的策略将避免每1 000 例筛查妇女中增加约1 例癌症病例，与细胞学相比，改善非常小。然而，与仅行细胞学相比，基于高危HPV 检测的策略将使妇女接受更多的检查过程［5］。本研究中，以宫颈细胞学ASCUS+为阈值，灵敏度可达88.6%，但非典型鳞状细胞（ASCUS 及ASC-H）的占比较高（21/51），特异度较差，对临床的指导性不强。因此，需尽快找到可对宫颈癌前病变早期提示的标志物。

原癌基因扩增在高危HPV 的感染中较为常见，基因异常后引起细胞形态学异常，因此基因扩增可能是先发于形态学改变的早期事件。在宫颈癌的相关研究中，美国国家卫生研究院牵头的研究显示，3号染色体长臂扩增是宫颈癌变过程中不可忽视的遗传学改变。在3号染色体中的人类染色体端粒酶基因（TERC 基因，位于3q26.3）的异常可能是造成向宫 颈 癌转变的原 因［6］。 HESELMEYER-HADDAD等［7］通过 FISH 技术对宫颈细胞中的 hTERC 基因进行检测，63%的CIN2 和76%的CIN3 出现了hTERC基因拷贝数的增加，并且拷贝数和病情的严重性呈正比，能较好地预示高度病变。对研究入组患者进行随访，发现hTERC 基因扩增的患者1～3 年后有40.7% 从 CIN1/2 进展到 CIN3。ANDERSSON 等［8］亦报道了宫颈腺癌中单个细胞内TERC 基因平均拷贝数为3.3（范围为2.3～5.2）。通过荧光原位杂交法，运用荧光标记探针和样本DNA 进行特异度杂交，利用荧光显微镜可以观察到被标记的异常DNA。用FISH 检测TERC 扩增细胞比例≥5%在诊断宫颈病变方面有较高的灵敏度和特异度，可与HPV 结合用于宫颈癌筛查［2，9］。FISH 技术操作在细胞分裂间期也可实施，无需进行细胞培养，特异度和灵敏度佳，用于临床检测准确可靠，缺陷是费用较高，临床应用受限。

p16 蛋白是CDKN2A 基因（定位于9p21）编码的相对分子质量为16 kD 的蛋白，定位于细胞核内，对CDK4/6-CyclinD／Rb-E2F 环路起负性调控作用，阻止细胞由G1期进入S 期，一旦p16 基因缺失、突变，则不能抑制CDK4，最终导致细胞进入恶性增殖［10］。研究证实，p16 过度表达与HPV 感染及宫颈病变密切相关［11-13］。Ki-67 为MKI67 基因（定位于10q26.2）编码的核蛋白，在增殖期的细胞（G1、S、G2和M期）高表达。肿瘤分化的程度、转移、浸润和预后均可依据Ki-67 指数进行判断。KRUSE 等［14］发现，宫颈病变由CIN1 向CIN2 和CIN3 进展时可以参考Ki-67指标。

p16 和Ki-67 免疫组织化学联合检测已常规用于宫颈病变的组织学诊断。我国《宫颈癌及癌前病变病理诊断规范》指出，p16和Ki-67可用于鉴别高级别上皮内瘤变和低级别上皮内瘤变，以及不成熟化生、修复性改变等［15］。免疫组织化学法主要用于鉴别诊断，而免疫细胞化学可将鉴别诊断前移到筛查环节，有助于宫颈病变的诊断，避免不必要的阴道镜检查和活检。近年来，p16/Ki-67免疫细胞化学双染色已逐渐开始用于宫颈病变的临床诊断。IKENBERG等［16］报道了多中心 ASC-US 及 LSIL 基础标志物研究（PALMS）的结果，选取了5个欧洲国家的27 349例宫颈癌筛查者进行了宫颈细胞学、HPV、p16/Ki-67细胞学双染检测，发现在所有年龄组中，宫颈p16/Ki-67细胞学双染比宫颈细胞学涂片诊断CIN2+的灵敏度更高，而特异度相似。特别是在HPV 感染率高、检测特异度差的青年女性组，p16/Ki-67细胞学双染在宫颈癌筛查中有着高度灵敏度和良好的特异度。EL-ZEIN 等［17］报道了通过免疫染色试验确定上皮内瘤变的筛查分诊研究（STAIN-IT）的结果，从1 158例常规TCT、HPV 和活检结果有效的标本中随机选取492 例宫颈标本，进行回顾性p16/Ki-67 双染色细胞学检测，发现双染色细胞学阳性率随组织学严重程度的增加而增加，单纯双染色细胞学检查对CIN2+的诊断灵敏度低于HPV 检测，特异度高于HPV检测。李雨聪等［18］研究统计，p16/Ki-67细胞学双染对宫颈癌前病变诊断有较高的灵敏度及特异度，与本研究相符。周小会等［3］对中外12篇文献，累计 3 696 例患者进行了 Meta 分析，p16/Ki-67 细胞学双染检测诊断CIN2+的合并灵敏度为88%、合并特异度为64%，认为其灵敏度中等，而特异度较高，有助于对宫颈癌筛查异常患者的诊断。p16/Ki-67 双染对宫颈病变预后的影响亦有相关研究，CLARKE等［19］发现，在 HPV 阳性患者中，双染阳性导致 5 年CIN2+发生率显著升高，而阴性者发病率明显下降，认为p16/Ki-67 双染检测在5 年内可提供更好的长效风险分层管理，双染阴性者可适当延长筛查间隔。

p16/Ki-67二者结合在宫颈细胞学中的应用，可有效识别增殖细胞，有助于识别形态不典型的异常细胞或细胞团，指导诊断。但多需要专用制片仪器，如CINtec，价格昂贵，临床使用受限。我们在实验中发现，简化的手工制片技巧可使试验步骤更短，达到近似效果。本研究中，p16/Ki-67 检测和TERC 检测的诊断效能均优于传统的TCT/HPV 检测，其中p16/Ki-67 检测比TERC 灵敏度略低，但却有较高的特异度和相似的准确性，适合于CIN1-和CIN2+的鉴别诊断，指导异常细胞学结果的阴道镜转诊，尤其是ASCUS 的转诊。由于TERC 检测费用较高，且前期已针对TERC进行过大样本的筛查病例研究［2］，故本研究病例选择以CIN 病例为主，因此病例数偏少，以后将争取继续进行较大样本的研究。p16/Ki-67 细胞化学检测灵敏度和特异度均较高，有良好的诊断效能，操作简便，价格低廉，是一种更适合广泛开展的宫颈病变诊断方法。