体外助孕中未成熟卵子比例过高的临床因素分析

司蕊，盛燕，李静，高姗姗

山东大学附属生殖医院 山东大学生殖医学研究中心 国家辅助生殖与优生工程技术研究中心生殖内分泌教育部重点实验室，济南250021

体外助孕过程中，需通过合适的促排卵用药获得一定量的成熟卵母细胞进行体外受精。而获得卵子的成熟比例低或卵子成熟度差，往往影响整个体外助孕的结局。卵子成熟是一个复杂精密的过程。研究显示，诸多卵子成熟的关键基因缺失或表达异常可能导致女性无法产生成熟卵子［1］。但除外这些内在原因所致的卵子成熟问题，临床生殖医师通常发现促排卵方案、降调药物与拮抗剂药物的使用等均可能影响获得卵子的成熟比例。本研究通过对2017 年—2018 年卵子成熟比例低于40%的卵胞浆内单精子显微注射技术（ICSI）助孕周期与对照组进行回顾性队列分析，旨在发现可能影响卵子成熟比例的相关临床因素，以期对辅助生殖的临床工作提供指导。

1 资料与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2017 年1 月—2018 年12 月于山东大学附属生殖医院女性生殖科因男方因素行ICSI 助孕周期，并按相应条件分成两组，未成熟卵组：①获卵数＞3；②获卵中未成熟卵（减数第一次分裂MI 期或生发泡GV 期卵）占60%以上。共纳入155 例周期（发生率1.2%）。成熟卵组：按年龄、体质量指数（BMI）匹配后以1∶3 配对选取获卵数＞3 的卵胞浆内单精子显微注射技术胚胎移植（ICSI-ET）周期中成熟卵比例90%以上的周期。本研究经山东大学附属生殖医院伦理审查委员会批准通过。患者均签署知情同意书。

1.2 促排卵方案 根据患者年龄、体质量、卵巢储备指标等制定促排卵方案。控制性超促排卵（COS）方案：应用本院常用的促排卵方案，包括黄体期长方案、短方案、拮抗剂、其他方案。黄体期长方案：在取卵周期前1 个月经周期的黄体中期，应用促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa）0.05～0.1 mg/d 垂体进行降调节，13～14 d 后行阴道超声检查并抽静脉血测血清。当达到降调标准时，根据患者年龄、窦卵泡大小与个数、体质量指数，抗苗勒氏管激素（AMH）及血清激素水平决定启动促性腺激素（Gn）的剂量，直至人绒毛膜促性腺激素（HCG）注射日。定期监测卵泡发育情况及血清促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）水平，当患者双侧卵巢至少有2～3 个主导卵泡直径≥18 mm 时，肌注 HCG 诱发排卵，注射HCG 36 h 后在B 超引导下经阴道取卵。短方案：月经第2～4 d开始使用短效GnRHa 0.1 mg直至 HCG 日，GnRHa 后 1～2 d 开始 Gn 促排卵，Gn 的启动量及调整，扳机时机同长方案。拮抗剂方案：月经第1～4 天开始给予Gn 启动。并根据卵泡大小及激素水平灵活添加拮抗剂：主导卵泡直径≥11～12 mm，和/或LH＞10 IU/L（或大于基线水平2 倍）或E2水平＞200～300 pg/mL时添加促性腺激素释放激素拮抗剂（GnRH-A）0.125～0.25 mg/d。当患者双侧卵巢至少有1～2 枚个主导卵泡直径≥18 mm 时，肌注HCG 或GnRha+HCG 扳机诱发排卵。从促排卵方案使用比例、用药、卵泡大小比例、不同阶段各激素水平及取卵时机等方面比较两组情况。

1.3 卵子成熟度的确定 取卵后每位患者均按常规行ICSI 进行授精。行ICSI 的卵子于取卵后4 h 用透明质酸酶去除颗粒细胞，确定卵母细胞的成熟度，选取MII期卵母细胞行ICSI操作。

1.4 实验室及妊娠结局计算 受精率=2PN（PN）数/MII 卵数；放弃周期率=无可移植胚胎及冻胚周期数/总周期数；活产率=活产周期/移植周期。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料符合正态分布用表示，组间比较采用t检验、t'检验；计数资料组间比较采用χ2检验。采用Logistic 回归分析各参数与未成熟卵比例高的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 未成熟卵组与成熟卵组周期数分别为155、480 个，原发不孕比例分别为57.42%、43.75%，第1 周期比例分别为56.77%、65.21%，未成熟卵组的原发性不孕比例较高（P＜0.05），余各项指标比较差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

表1 未成熟卵组与成熟卵组患者基本情况比较（）

表1 未成熟卵组与成熟卵组患者基本情况比较（）

参数不孕年限（年）年龄（岁）基础FSH（IU/L）基础LH（IU/L）基础E2（pg/mL）基础T0（ng/mL）体质量（kg）BMI（kg/m2）未成熟卵组4.19± 3.07 31.58± 4.61 6.64± 2.13 5.00± 2.89 37.32±15.65 0.25± 0.15 61.72± 8.41 23.78± 3.31成熟卵组4.16± 3.34 31.99± 4.71 6.62± 1.96 5.35± 3.73 36.31±14.45 0.24± 0.14 61.55± 9.16 23.84± 3.53 P 0.919 0.350 0.424 0.862 0.119 0.203 0.846 0.843

2.2 两组促排卵相关参数比较 见表2。

表2 未成熟卵组与成熟卵组促排卵相关参数比较

2.3 未成熟卵比例高的多因素Logistic 回归分析 促排卵方案、≥18 mm/14～17 mm 卵泡比例、HCG 日14 mm 以上大卵泡平均E2 是未成熟卵比例高的独立危险因素（P均＜0.05）。

3 讨论

促排卵是体外助孕过程中重要的一环，通过对方案的选择，药物种类及剂量的把控及对卵泡大小、性激素的监测来获得体外助孕所需的一定量的成熟优质卵子。目前在COS 过程中，通过卵巢储备、年龄、体重及既往促排卵反应等因素决定促排卵方案、Gn 启动剂量等，在 COS 过程中，通过 B 超、激素水平监测决定扳机时间。但由于患者的个体差异、医师促排卵经验差异等各种因素，可能出现最终获卵少、获卵中未成熟卵比例增加等情况。卵子成熟比例下降明显影响周期结局，本研究发现在未成熟卵组，即使是成熟卵子的受精率较对照组亦有下降，差异有统计学意义，提示在未成熟卵比例较高的周期中同批所获得成熟卵子也可能存在胞质成熟不同步的可能。周期结局显示未成熟卵组的放弃周期远高于对照组（46.45%vs 7%），周期平均冻胚数亦明显减少。因此，体外助孕治疗中获得较高比例成熟卵子是非常重要的。本研究拟从临床角度出发，分析获卵中未成熟比例较高患者本身的基础特征、促排卵过程的具体指标等因素，以期发现体外助孕中不同促排卵方案中可能导致未成熟卵比例增加的原因，以指导临床工作。

正常状态下，COS 周期中获得的卵母细胞中15%左右在减数分裂Ⅰ期（MI）或是生发泡期［2］。获得高比例的未成熟卵的周期大部分是由于患者本身因素或促排卵过程中控制不良所致［3］。本研究总体资料的基础情况显示，未成熟卵组的原发性不孕患者比例较高，提示未成熟卵组中存在患者本身因素。卵子质量与患者年龄呈明显相关性［4］，而获卵数与年龄可能也存在一定关系［5］。本研究中主要分析促排卵过程的相关指标对卵子成熟的影响，对照组已按年龄配比，以排除年龄因素的影响。

分析整体的促排卵情况发现，短方案比例在成熟卵组明显高于未成熟卵组。由于短方案存在Gn-RHa 的短时激发作用，对于垂体的抑制较轻，LH 维持于一个较高的水平［6］。多因素回归分析印证，相较于长效降调方案，短方案更有利增加卵子成熟比例。另一发现为未成熟卵组Gn总量高于成熟卵组，同时未成熟卵组的大卵泡相对比例（≥18 mm/14～17 mm 卵泡）低于成熟卵组。这提示未成熟卵组的卵巢反应性较差，致使卵泡发育不均，成熟卵比例降低。回归分析发现，扳机日E2/成熟卵泡数也是未成熟卵比例高的相关因素，这与王丽等［7］研究结论一致。

不同的COS 方案对内源性LH 的调控机制的不同，整体的分析难以发现不同方案的特征性问题。因此，本研究对长方案、短方案及拮抗剂方案三种常规方案进行了亚组分析。长方案资料分析，扳机日18 mm 以上大卵泡比例有下降趋势，提示有非预期的卵巢低反应发生而增加了未成熟卵比例。短方案资料分析发现，基线参数比较提示未成熟卵组的窦卵泡个数较少，提示该组卵巢储备差，促排卵情况的比较亦显示了临床医师针对该组较低储备的情况增加了启动量及扳机HCG 用量，但扳机日大卵泡比例及雌激素水平提示仍发生了卵巢低反应的情况。综上两种方案，患者的预期或非预期的卵巢反应不良，卵泡发育不均匀，都可增加卵子不成熟比例。拮抗剂方案的数据分析提示，未成熟卵组的基础LH 水平低于成熟卵组，而促排卵过程中使用GnRHant 总量反而高于成熟卵组，同时未成熟卵组拮抗剂使用天数较成熟卵组有延长趋势。提示在拮抗剂方案未成熟卵组中，存在自身LH 功能基础的相对不足，和/或存在过早或过量地使用拮抗剂导致继发的LH过低情况。

卵泡直径是评估卵子发育潜能的重要指标［3］。较小的卵泡其卵母细胞核质成熟差，发育潜能差［8］。HAINES 等［9］研究指出，在直径 15～23 mm 卵泡中获得的卵母细胞能获得最为正常的妊娠。而从直径大于23 mm 的卵泡中取卵，获卵数下降［10］。这导致非同步发育的卵泡群中过大卵泡不易获得卵子，而较小卵泡获得未成熟卵或发育潜能差的卵子，从而影响助孕结局。因此，同步发育的主导卵泡群是获得优质卵子和胚胎的关键因素。最大卵泡直径无法体现总体卵泡群的发育情况及卵泡发育的同步性。因此本研究采用18 mm/14～17 mm 卵泡数这一参数。多元回归分析结果发现，18 mm/14～17 mm 卵泡数下降是未成熟卵比例增加的相关因素，与李媛［3］研究结果一致。

LH 是卵泡发育成熟不可或缺的一环，LH 不仅能促进卵泡的生长，还能触发卵母细胞的减数分裂恢复，促进卵母细胞的最后成熟。促排卵过程中低LH 会导致FSH 用量增大、促排卵时间延长、获卵率低、受精下降、降低妊娠结局等［11］。本研究中扳机日E2/成熟卵泡数比值下降即为LH 相对不足的体现。超促排卵中由于降调或拮抗剂应用后导致的LH 相对低同时继发的卵巢反应不良及卵泡不同步现象。而本研究中拮抗剂方案未成熟卵组体现了过早/过量地使用拮抗剂的情况。但同时不排除不孕症患者存在LH 受体表达异常，由于患者LH 受体水平的个体差异，导致LH 相对低的现象［12］。研究已证实，在LH 受体的变异（V-βLH 携带者）［12］患者或低预后人群［13］添加LH有利于改良卵巢反应及妊娠结局。

有研究发现对于长方案获卵数较少者，HCG 扳机后延迟取卵时间可增加MII 卵子数［14］。本研究中，两组无论是整体分析还是不同促排卵方案中分析均未发现扳机至取卵之间时间有差异，这可能是常规临床工作的统一控制有关。是否延迟时间取卵，并且延迟多长时间能增加成熟卵比例需要进一步前瞻性研究。本研究回顾性分析了155 例未成熟卵比例大于60%的体外助孕周期，一方面样本量较小，另一方面由于无法排除部分患者是否存在内源性因素（如LH 受体表达异常等），从而不能更有效地分析促排卵临床相关原因。对于连续卵子成熟比例低的患者，可考虑行已知相关基因的检测。

综上所述，促排卵过程中由于各种原因造成的卵泡发育不同步，以及由于各因素导致的LH 低水平是导致成熟卵比例下降的相关因素。短方案的特点可能更有利于增加成熟卵的比例。扳机日18 mm/14～17mm 卵泡数能更好评估主导卵泡群的同步性。