变应性鼻炎患者血清let-7e、miR-155-5p 表达及其与Treg/Th17细胞平衡的关系

杨好喜，龚淑敏，王虹

1 南开大学附属医院 天津市第四医院耳鼻喉科，天津300222；2 南开大学附属医院 天津市第四医院内科

变应性鼻炎（AR）是一种主要由IgE介导的鼻变态反应性疾病，临床主要表现为反复喷嚏、瘙痒、鼻漏、鼻塞和鼻充血，可严重影响生活、学习和工作［1］。免疫反应是AR 发病的病理基础，辅助性T 细胞17（Th17）、调节性T 细胞（Treg）互相拮抗维持机体免疫状态相对稳定，Th17/Treg 失衡被证实可参与AR发生［2］。微小RNA（miRNA）是多种疾病发病的调控因子，参与哮喘、AR 发病过程［3］。let-7e是由22个核苷酸组成的内源性非编码miRNA，通过靶向细胞因子信号抑制因子4（SOCS4）抑制AR 小鼠白细胞介素-13 刺激介导的鼻上皮细胞炎症因子表达，在AR病情进展中发挥保护作用［4］。金晶晶等［5］研究发现，miR-155-5p 参与免疫、炎症反应及细胞分化发育，在Treg/Th17 平衡调控中扮演重要角色。let-7e、miR-155-5p 是否参与 AR Treg/Th17 平衡调控尚不清楚。本研究检测AR 患者血清let-7e、miR-155-5p 表达，分析二者与Treg/Th17 平衡的关系，以期为临床诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择 2018 年 1 月—2019 年 6 月我院耳鼻喉科收治的98例AR患者。纳入标准：①典型阵发性喷嚏、流鼻涕、鼻痒、鼻塞，符合2015 年天津AR诊治指南相关标准［6］；②年龄18周岁以上；③知情同意并签署同意书。排除标准：①血管运动性鼻炎、非变应性鼻炎伴嗜酸粒细胞增多综合征、感染性鼻炎、激素性鼻炎、药物性鼻炎等其他鼻部疾病；②近1 个月未服用抗组胺、糖皮质激素药物；③近期罹患急慢性感染性疾病。其中，男50 例、女48 例，年龄23～56（34.41 ± 4.72）岁；IgE 阳性 68 例，阴性 30例；变应原种类：季节性AR（花粉、真菌）57 例，常年性AR（尘螨、蟑螂、动物毛发等）41 例；症状发作时间：间歇性AR（症状发作＜4 天/周或＜连续4 周）53例，持续性AR（症状发作≥4 天/周或≥连续4 周）45例；疾病严重程度：轻度AR（症状轻微，对生活影响小）37 例，中重度AR（症状重，严重影响生活质量）41 例；伴支气管哮喘39 例。另选择60 例健康志愿者为对照组，健康志愿者均为我院门诊体检健康者。男 32 例、女 28 例，年龄 21～52（35.95 ± 4.61）岁。两组受试者性别、年龄比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。本研究获得我院伦理委员会批准。

1.2 血清let-7e、miR-155-5p表达和Treg/Th17及其相关细胞因子检测 AR 患者入院后24 h（健康志愿者体检当日）采集肘静脉血3 mL，注入EDTA 抗凝管混匀，4 ℃、2 000 r/min 离心10 min（离心半径15 cm），取上层血清于EP 管置于-80 ℃超低温冰箱保存。RT-PCR 法检测 let-7e、miR-155-5p 表达：TRIzol 法提取总RNA，采用M-MLV 逆转录酶（Epicentre 公司）按照试剂盒说明将其转录为cDNA。CFX96 实时荧光PCR 仪（美国Bio-Rad）检测血清中miR-155-5p、let-7e表达，引物合成及序列测定由上海基康生物技术有限公司完成，引物序列：let-7e 正向引物5'-TGAGGTAGGAGGTTGTATAGTT-3'，反 向 引 物 5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；miR-155-5p正向引物5'-CCGCGCTTAATGCTAATTG-3'，反向引物 5'-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3'。反应条件：95 ℃变性 10 s，65 ℃退火 20 s，75 ℃延伸 15 s，共40 个循环。以 U6 snRNA 为内参，2-ΔΔCt法计算 miR-155-5p相对表达量，共做3 次平行试验，取平均值。ΔΔCtmiR-155-5p =ΔCtmiR-155-5p -ΔCtU6 snRNA，ΔΔCtlet-7e=ΔCtlet-7e-ΔCtU6 snRNA。

EPICS-XL 流式细胞仪检测 Th17、Treg 细胞占比，计算Th17/Treg。酶联免疫吸附试验检测血清白细胞介素-6（IL-6）、IL-17、IL-22、IL-23、IL-10、转化生长因子-β1（TGF-β1）水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料符合正态分布以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两对比采用LSD-t检验，两组间比较采用独立样本t检验。计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验。采用Pearson 相关分析变量之间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清 let-7e、miR-155-5p 表达和 Treg、Th17及其相关细胞因子比较 AR组与对照组血清let-7e相对表达量分别为0.72±0.21、1.35±0.46，miR-155-5p相对表达量分别为1.81±0.35、1.15±0.26，AR组let-7e表达、Treg细胞、Treg/Th17、IL-10、TGF-β1低于对照组（P均＜0.05），miR-155-5p表达、Th17细胞、IL-6、IL-17、IL-22、IL-23高于对照组（P均＜0.05），见表1。

表1 两组外周血Treg细胞、Th17细胞及其相关细胞因子水平比较（）

表1 两组外周血Treg细胞、Th17细胞及其相关细胞因子水平比较（）

注：与对照组相比，*P＜0.05。

组别AR 组对照组TGF-β1（ng/L）50.34±6.43*89.34±12.34 n 98 60 Treg细胞（%）2.31±0.35*4.86±0.79 Th17细胞（%）1.35±0.37*0.52±0.17 Treg/Th17 1.71±0.30*9.35±0.51 IL-6（ng/L）6.12±1.24*3.26±0.75 IL-10（ng/L）50.21±6.35*89.35±10.47 IL-17（ng/L）16.35±2.95*5.39±0.94 IL-22（ng/L）19.35±5.26*8.56±3.26 IL-23（ng/L）35.15±9.35*21.35±6.57

2.2 不同临床参数AR 患者血清let-7e、miR-155-5p 表达比较 中重度者血清let-7e 表达低于轻度者（P＜0.05），miR-155-5p 表达高于轻度者（P＜0.05）。IgE 阳性者血清let-7e 表达低于阴性者（P＜0.05），miR-155-5p 表达高于阴性者（P＜0.05）。伴哮喘者血清let-7e 表达低于无哮喘者（P＜0.05），miR-155-5p 表达高于无哮喘者（P＜0.05）。不同年龄、性别、变应原、症状发作时间let-7e、miR-155-5p 表达无统计学差异（P均＞0.05），见表2。

表2 不同临床参数AR患者血清let-7e、miR-155-5p表达差异

2.3 血清 let-7e、miR-155-5p 表达与 Treg/Th17 的相关性 血清let-7e 表达与Treg、Treg/Th17 呈正相关（r分别为 0.406、0.467，P均＜0.05），与Th17 表达呈负相关（r=-0.512，P＜0.05）。miR-155-5p 表达与Treg、Treg/Th17 呈负相关（r分别为-0.495、-0.468，P均＜0.05），与 Th17 表达呈正相关（r=0.598，P＜0.05）。

2.4 血清let-7e、miR-155-5p表达与Treg、Th17相关细胞因子相关性 血清let-7e 表达与IL-10、TGF-β1水平呈正相关（r分别为0.435、0.467，P均＜0.05），与 IL-6、IL-17、IL-22、IL-23 水平呈负相关（r分别为-0.419、-0.464、-0.406、-0.312，P均＜0.05）。miR-155-5p 表达与 IL-10、TGF-β1水平呈负相关（r分别为-0.457、-0.368，P均＜0.05），与 IL-6、IL-17、IL-22、IL-23 水平呈正相关（r分别为 0.437、0.538、0.495、0.398，P均＜0.05）。

2.5 血清let-7e、miR-155-5p 表达的相关性 血清let-7e 表达与miR-155-5p 表达呈负相关（r=-0.594，P＜0.05）。

3 讨论

AR是临床最常见的非传染性鼻炎，以鼻黏膜慢性炎症为主要特征。近年来随着环境改变，就医条件提高，AR 检出率逐渐上升。据报道，我国AR 的发病率为4%～38%［6］。AR 的发病机制复杂，肥大细胞、嗜酸性粒细胞、Th2 型细胞、炎症介质等均参与其中，Th17、Treg 细胞具有共同的前体细胞即CD4+T 细胞，由TGF 分化下形成，被认为是Th1/Th2的分支。Th17 细胞引起自身免疫和炎症反应，Treg细胞则抑制免疫和炎症反应、维持免疫稳态。生理情况下，Th17/Treg 处于动态平衡，保持免疫稳定。Th17/Treg 失衡可能导致机体炎症反应、自身免疫疾病的发生［7］，AR 患者 Th17 细胞增加，Treg 细胞减少，Th17/Treg 处于失衡状态［3］。Th17、Treg 细胞分化和平衡调节通过细胞内转录、信号途径实现，miRNA在免疫细胞发育分化中起调控作用，其异常表达可能导致免疫紊乱［3］。

let-7e 是 miR-let-7 家族 miRNA，参与胚胎发育、干细胞分化、炎症反应、肿瘤发生、神经系统疾病产生等多种生理和病理过程［8］，在炎症反应中let-7e被抑制，增加促炎细胞因子表达，加剧炎症反应［9］。动物实验显示，let-7e 过表达可抑制炎症因子、组胺、IgE 和 TNF-α 水平，在 AR 中发挥抗炎作用［3］。let-7e在AR、哮喘患者鼻腔黏膜中表达下调［10］。本研究发现，AR 患者血清 let-7e 表达明显降低。LI 等［3］研究结果显示，let-7e 通过激活JAK1/STAT3 通路靶向抑制SOCS4 表达，改善AR 症状和病情进展。提示let-7e 缺失可能引起SOCS4 过表达，导致免疫缺陷和炎症反应，促使AR 发生和进展。let-7e 是否通过Treg/Th17 参与AR 发病机制尚不清楚。有研究显示，let-7e 可促进 Th17 细胞发育，let-7e 通过靶向TLR4调节巨噬细胞内毒素耐受性［11］。本研究发现，与对照组比较，AR 组 Treg 细胞、Treg/Th17 均降低，Th17 细胞增高，AR 患者 Treg/Th17 系统处于失衡状态，let-7e 表达与 Treg、Treg/Th17 呈正相关，与 Th17表达呈负相关，说明let-7e 表达缺失可能导致Th17过表达，Treg表达受抑制，介导和加剧炎症反应。研究显示，给予let-7e 激动剂可改善AR 小鼠鼻黏膜结构，抑制炎性细胞浸润，降低Th17 细胞亚群占比、IgE、IL-17A 水平，提高 Treg 细胞亚群占比、IL-10 水平［12］，let-7e表达有助于维持Treg/Th17细胞平衡，减轻炎症反应。let-7e可能通过调控Treg/Th17系统参与AR发病机制。

miR-155-5p 是 miR-155 家族成员，来源于 B 细胞整合簇，B 细胞整合簇功能通过miR-155 二级结构实现，miR-155 在人胸腺、脾脏、肺等富含免疫细胞器官中高度表达，在Th细胞分化、细胞因子生成、免疫监管中发挥重要作用［13］。有研究显示，miR-155在免疫性血小板减少症患者中表达上调，且与B淋巴细胞功能相关［14］，miR-155在过敏性紫癜患者表达升高，参与调节过敏性气道炎2 型固有淋巴细胞、IL-33信号传导［15］。本研究观察了 miR-155-5p 在 AR 患者外周血中也出现表达上调，与 SUOJALEHTO 等［10］报道结果一致。相关性分析结果显示，miR-155-5p 与Treg、Treg/Th17呈负相关，与Th17表达呈正相关，说明miR-155-5p 过表达与Treg/Th17 免疫失衡有关。临床报道显示，miR-155 过表达与过敏性紫癜患儿Treg/Th17 细胞失衡有关，miR-155 与 Th17 细胞占比及其特异性转录因子RORγt 呈正相关，与Treg 细胞及其转录因子 Foxp3 呈正相关［16］。研究显示，miR-155-5p 过表达可加重AR 小鼠鼻炎症状，促进IgE、Th17 相关细胞因子表达，抑制Treg 相关细胞因子表达［17］。miR-155-5p调控Treg/Th17平衡的机制尚未完全阐明，miR-155通过抑制靶基因Jumonji富含AT 结合结构域 2，促进 Th17 细胞功能［18］，miR-155 通过SOCS1 负向调控IL-2 受体信号通路，调控Treg 细胞分化［19］。

IL-10 是let-7e 的功能靶点，可抑制炎性细胞激活、迁移和黏附，起到抗炎作用［20］。TGF-β1可抑制免疫细胞增殖、淋巴细胞分化、炎性细胞因子产生，并能诱导 Treg 细胞产生，TGF-β1、Treg 细胞在 AR 患者均降低，TGF-β1/Treg 参与 AR 发病［21］。IL-6 可促使 CD4+T 细胞向 Th17 细胞分化，IL-17、IL-22、IL-23是Th17 细胞相关因子，具有介导T 细胞炎症反应作用，在 Th17 反应为主的 RA 患者中 IL-6、IL-17、IL-22、IL-23 水平明显升高。本研究相关分析结果显示，let-7e 与 IL-10、TGF-β1呈正相关，miR-155-5p 与之呈负相关，let-7e 与 IL-6、IL-17、IL-22、IL-23 呈负相关，miR-155-5p 与之呈正相关，miR-155-5p 与 let-7e 呈负 相关 ，说 明 miR-155-5p、let-7e 在 RA 患者Treg/Th17 平衡调节中发挥相互调节、相互抑制作用，miR-155-5p 过表达，let-7e 表达缺失可诱导 Th17相关细胞因子释放，抑制Treg 相关细胞因子合成，进而增加炎症反应。

本研究发现，miR-155-5p、let-7e 表达均与 AR 疾病严重程度、IgE 表达、是否伴哮喘有关，说明miR-155-5p、let-7e表达水平可反映AR 病情，为病情评估提供一定参考。IgE 介导的Ⅰ型变态反应是AR 发病的核心机制，IgE 水平越高，AR 发作强度越大［22］，因此IgE 阳性病例Treg/Th17 平衡破坏更严重。AR与哮喘属于“同一气道、同一疾病”，伴哮喘的AR 患者局部气道、全身炎性反应更重，Treg/Th17 失衡更明显。

综上所述，AR 患者血清let-7e 表达下调，miR-155-5p 表达上调，let-7e 表达缺失，miR-155-5p 过表达介导的Treg/Th17 失衡可能参与AR 发病和病情进展。let-7e、miR-155-5p在AR Treg/Th17失衡机制中可能发挥相互调节、抑制作用。