羊源D型产气荚膜梭菌分离鉴定及耐药性与致病性分析

赵学亮，王晨骁，王 斌，冯 航，叶 超，党如意，王 娟，杨增岐

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)是广泛存在于食物、土壤、水源、粪便及人畜消化道的一种条件性致病菌[1]。该菌由英国人WELCHII于1982年在腐败尸体中分离获得，从而命名为魏氏梭菌。它可以分解机体内的糖产生气体，还可以形成荚膜，故又称为产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)[2]。产气荚膜梭菌是一种革兰阳性厌氧菌，属于杆菌科梭菌属，可导致畜禽气性坏疽、坏死性肠炎、猝死症、肠毒血症、羔羊痢疾以及人的食物中毒等多种疾病[3-6]。该菌致病作用主要由于它所产生的毒素所导致，目前已经发现的毒素有20种，主要致死毒素为α、β、ε和ι，根据产生这4种毒素的能力将该菌分为A(产α毒素)、B(产α、β和ε毒素)、C(产α和β毒素)、D(产α和ε毒素)和E(产α和ι毒素)5个型[7]。

近20年来，产气荚膜梭菌病严重制约养羊业的发展，给畜牧业带来巨大经济损失的同时威胁人类健康。CHUKWU等[8]从食品中检测出A型和D型产气荚膜梭菌，据报道该菌已严重影响尼日利亚食品公共卫生。在我国，关于A型产气荚膜梭菌的分离鉴定报道较多[9-10]，有关D型产气荚膜梭菌临床分离株的报道相对较少。孟莉等[11]于2018年在急性死亡的奶山羊小肠中分离到D型产气荚膜梭菌，分离株不仅对卡那霉素、庆大霉素和链霉素等耐药，同时具有较强的毒力。D型产气荚膜梭菌以其高致病性的α和ε毒素诱发羊肠毒血症，导致急性死亡。2020年9月，内蒙古乌审旗膘情较好的放牧绵羊陆续出现卧地痉挛、突然死亡的情况，剖检主要表现为肠毒血症、坏死性肠炎和小肠黏膜严重出血。本试验从内蒙古乌审旗猝死绵羊小肠中分离出1株致病菌，经分离培养、16S rRNA扩增测序、毒素基因PCR鉴定、生化鉴定及药敏试验，确定为D型产气荚膜梭菌。本试验旨在对指导羊源D型产气荚膜梭菌合理用药、减少多重耐药菌株的出现提供依据，为分离株耐药基因及耐药机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料采集内蒙古乌审旗某放牧羊群中突发死亡羊只，解剖后可见心包积液，心脏及肺脏有出血点，回肠充血、出血。无菌采集病死羊的肝脏、肺脏、肠道及内容物立即放入冰箱冷冻保存，无菌条件下带回实验室分离细菌。

1.2 主要试剂及仪器营养琼脂培养基、厌氧肉肝汤培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司；生化试剂购自杭州滨和微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Ladder购自北京Genstar生物科技有限公司；引物由西安擎科生物技术有限公司合成。离心机、PCR仪及移液枪购自Eppendorf公司；超净工作台购自济南鑫贝西生物技术有限公司等。

1.3 细菌分离及培养将无菌采集的样品加入到厌氧肉干汤培养基中，37℃厌氧箱中培养18～24 h后划线接种TSC平板，然后选择黑色菌落接种鲜血琼脂平板，厌氧培养16～20 h后，挑取带溶血环的单菌落进行革兰染色和显微镜检查。

1.4 分离株16S rRNA扩增及测序按照天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒说明进行分离株DNA提取，以16S rRNA通用引物(表1)进行PCR扩增，反应体系(25 μL)：2×Easy Taq PCR Super mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，灭菌ddH2O补齐至25 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

16S rRNA基因的PCR扩增产物送至西安擎科生物技术有限公司测序，将测序结果在NCBI中进行Blast比对，选取同源性相近的序列，应用MEGA 7.0软件对选取的序列进行同源性分析及进化树构建。

1.5 主要毒素基因PCR鉴定以1.4中提取的基因组DNA为模板，利用参考文献[12]中的引物(表1)，进行α毒素(CPA)、β毒素(CPB)、ε毒素(ETX)、ι毒素(ITX)扩增，预期片段分别为：325，236，585，445 bp。同时参考文献[13]建立的方法进行多重PCR扩增试验。PCR反应产物经胶回收试剂盒纯化后送往擎科生物技术有限公司进行测序，将所得序列与GenBank梭菌毒素基因序列进行比对。

表1 PCR鉴定引物序列信息

1.6 生化鉴定及药敏检测取厌氧肉干汤培养基中的分离株纯培养物，利用杜氏小管进行常规生化试验。取纯培养物，制备0.5麦氏浊度菌悬液，吸取100 μL均匀涂布于MH琼脂培养基上，放置5片实验室自制的药敏纸片，倒置在37℃厌氧培养箱中24 h后测量抑菌圈直径，按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)和M100抗微生物药物敏感性试验执行标准(2020中文版)进行判定。

1.7 动物致病性试验将9只3周龄健康昆明小鼠随机分为3组，每组3只。取分离菌的纯培养物(未用0.22 μm滤器过滤)，第1，2组分别腹腔注射0.2，0.3 mL/只(2×108～3×108CFU/mL)，第3组作为阴性对照，注射生理盐水0.3 mL/只，接种后分开饲养，每小时观察小鼠情况。剖检小鼠，观察组织器官病理变化，采集肝脏、肺脏、小肠等组织，分离细菌。

2 结果

2.1 分离株形态及培养特征分离株为厌氧菌，在TSC平板上37℃培养24 h后形成黑色菌落，在血琼脂平板上形成圆形、灰白色、表面光滑、边缘整齐的菌落，并有明显的溶血环。分离株染色特征为革兰阳性菌，菌体呈两端钝圆的粗大短杆状、无鞭毛、短链较少，单个或成双排列。根据细菌形态及培养特征初步表明分离株可能是产气荚膜梭菌(图1)。

图1 分离株革兰染色

2.2 16S rRNA基因PCR扩增及同源性分析在血琼脂培养基上获得纯培养物，选取单克隆菌落，提取细菌DNA，经16S rDNA通用引扩增后获得与1 386 bp 相符的条带(图2)，测序后经Blast比对分析确定为产气荚膜梭菌。将分离菌株16S rRNA序列命名为“NMG-1”，测序结果与其他15株(14株梭菌和1株大肠杆菌)同源性较近的菌株16S rRNA参考序列进行比对，系统进化分析显示NMG-1株与GenBank中武汉分离株MT613499.1同源性99.49%，不同分型和来源的产气荚膜梭菌16S rRNA序列同源较高，但与不同种间差异较大，与大肠杆菌AF289502.1遗传距离最远，同源性仅为80.21%(图3)。

M.DL2000 DNA Marker；1，2.分离株；3.阴性对照

图3 产气荚膜梭菌NMG-1系统进化树

2.3 NMG-1株毒素基因PCR扩增提取细菌基因组DNA，对产气荚膜梭菌α、β、ε和ι 4种毒素进行PCR扩增，可见325 bp的α毒素、584 bp的ε毒素特异性条带，未见β和ι毒素条带(图4)。同时用多重PCR对4种毒素进行扩增，结果出现与预期相符的特异性条带。将PCR产物测序，序列结果与GenBank中的α和ε毒素基因同源性为100%，由于D型产气荚膜梭菌可产生α和ε毒素，因此可确定分离菌为D型产气荚膜。

M.DL700 DNA Marker；1.α毒素；2.β毒素；3.ε毒素；4.ι毒素

2.4 NMG-1株生化特性将分离的NMG-1菌株按《伯杰细菌鉴定手册》标准进行乳糖、葡萄糖、麦芽糖、三糖铁、硫化氢、蛋白胨水、尿素、枸橼酸和甘露醇生化鉴定，根据菌株生化试验结果(表2)，判断为产气荚膜梭菌。

表2 NMG-1株生化鉴定结果

2.5 NMG-1株药敏试验结果分离菌对阿莫西林、复方阿莫西林、氨苄西林、氨苄青霉素、头孢噻呋钠、链霉素、庆大霉素、新霉素、替米考星、磺胺异恶唑等完全耐药，对泰万菌素、泰乐菌素、恩诺沙星表现为中敏，对多西环素、金霉素、土霉素、泰妙菌素、氟苯尼考表现为极敏。

2.6 NMG-1株小鼠致病性试验小鼠注射0.2 mL菌液后8 h全部死亡，小鼠注射0.3 mL菌液3 h内全部死亡，而注射生理盐水的对照组小鼠无异常。将试验组死亡小鼠剖检后，可见肠黏膜严重充血、淤血和水肿，接种环无菌穿刺病死小鼠肝脏，接种血琼脂平板，厌氧箱37℃培养24 h，经革兰染色及鉴定，得到与NMG-1相同的菌株。结果表明，NMG-1分离株对小鼠具有较强的致病性。

3 讨论

内蒙古乌审旗拥有丰富的优质天然草牧场，是鄂尔多斯细毛羊(210万只)的主产区。2020年9月乌审旗100多只放牧绵羊陆续死亡，多数为四肢抽搐、突然死亡，有的则无临床症状、悄然死亡。本试验从猝死羊小肠中分离出致病菌，通过细菌分离培养、革兰染色、生化鉴定、16S rRNA序列鉴定，确定为产气荚膜梭菌。产气荚膜梭菌病是一种重要的人兽共患病，其释放的致病毒素可导致动物猝死，也可导致人食物中毒。通过毒素基因PCR及多重PCR确定为D型产气荚膜梭菌，多重PCR是在普通PCR基础上加入多对引物，在一个PCR管中同时检测多种毒素，从而进行产气荚膜梭菌分型[14]。

D型产气荚膜梭菌引起羊肠毒血症，剖检病死动物时又因肾组织软化，故又称为“软肾病”[15]。动物采食被D型产气荚膜梭菌污染的饲料或饮水，细菌进入小肠大量繁殖并产生毒素导致迅速死亡[16-17]，往往来不及使用药物，因此对于该病的预防，免疫接种尤为重要[18]。早在20世纪80年代，我国就研制出产气荚膜梭菌的单价苗和多价灭活苗，对该病的预防发挥重要作用。在本次发病过程中，羊群已用“B型引起的羊黑疫、C型引起的羊猝狙、D型引起的羊肠毒血症、腐败梭菌引起的羊快疫”三联四防菌苗进行免疫接种，但仍陆续出现发病现象，因此开发一种安全性高、稳定性好，能够预防多种产气荚膜梭菌病的亚单位疫苗尤为重要。但是羊在发病到死亡期间曾长时间自由采食青草，由于秋季放牧草原富含蛋白质，被动物采食后通过胰蛋白酶转化成ε原毒素，从而继发羊肠毒血症。因此怀疑此次疫情的发生与长时间采食高蛋白的青草果实有必然联系。

近年来，内蒙古乌审旗羊梭菌病呈散发形势流行，对于该病的治疗能用抗生素及化学合成药[19]，但是由于抗菌药物在动物养殖过程中广泛使用甚至滥用加剧了产气荚膜梭菌耐药性的出现，并可通过“动物—食品/环境—人体”传播，危害食品安全和人类健康[20]。药敏试验表明，此菌株对阿莫西林、氨苄青霉素、头孢噻呋钠、链霉素、庆大霉素、新霉素、替米考星、磺胺异恶唑等表现100%耐药，说明这些抗生素在该地区羊群中广泛使用，从而导致了耐药性。由于临床上普遍用抗生素治疗产气荚膜梭菌，致使动物用药陷入“耐药菌↑→用药量/种类↑↑→耐药菌↑↑↑”的恶性循环，所以在选择用药时必须进行药敏试验，减少多重耐药菌株的出现。另外，司南等[21]通过对迁徙候鸟产气荚膜梭菌的耐药性情况进行分析，发现分离菌株对黏菌素、杆菌肽、克林霉素和红霉素的耐药率在40%以上，表明候鸟迁徙是耐药性传播的重要方式，同时候鸟对部分抗生素的高耐药性也值得关注。FAYEZ等[22]通过对骆驼源产气荚膜梭菌进行药敏分析，同样表明该菌耐药现象严重且为多重耐药。本试验小鼠致病性试验中，所有试验组小鼠8 h内全部死亡，表明该菌株具有很强的致病能力。因此，深入研究产气荚膜梭菌耐药性与致病性之间的关系，建立优化梭菌病原体的检测方法，研发制备行之有效的疫苗和药物，将对本病防治起到重要作用。