淫羊藿苷通过调控α-SMA和MMPs/TIMP的表达改善异丙肾上腺素所诱导的心肌纤维化

林小英，任星桥，曾凡群，黄 波，李叶丽，杨丹莉

(遵义医科大学药学院，基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

心肌纤维化可以降低心脏的顺应性，抑制心脏功能，引发心源性猝死[1]。由心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化而导致心肌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)代谢失衡是引发心肌纤维化的重要原因[2]。α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)是成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的重要标志[3]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)是调控心肌ECM合成与降解的重要酶系，其相互作用与ECM的动态平衡密切相关[4- 5]。

淫羊藿苷(icariin，ICA)是中药淫羊藿的主要活性成分，具有改善高血压、抗动脉粥样硬化和抗心肌缺血等作用[6]。本课题组前期研究发现，ICA可以调控MMP-9和TIMP-1的mRNA表达，抑制自发性高血压大鼠的心室重构[7]。异丙肾上腺素(ISO)是公认的制备左心室重构、心肌纤维化动物模型的工具药[8, 9]。但ICA对ISO诱导的心肌纤维化的干预鲜有报道。本研究借助造模工具药ISO，观察ICA对C57BL/6小鼠左心室心肌纤维化的干预作用，并基于α-SMA，MMP-2/9、TIMP-1探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物及试剂C57BL/6小鼠，♂，7周龄，SPF级，购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0014。ISO(货号：HY-B0468，MCE公司)；ICA(纯度≥98%，批号：FY17420615，购于江苏省南京泽朗医药有限公司)；氯沙坦(货号：HY-17512A，MCE公司)；Masson三色染色液(货号：G1345，Solarbio公司)；α-SMA兔抗小鼠抗体(货号：55135-1-AP，Proteintech公司)；MMP-2兔抗小鼠抗体(货号：D261446，BBI Life Sciences公司)；MMP-9兔抗小鼠抗体(货号：10375-2-AP，Proteintech公司)；TIMP-1兔抗小鼠抗体(货号：bs-0415R，北京博奥森生物技术有限公司)；GAPDH兔抗小鼠抗体(货号：10494-1-AP，Proteintech公司)；HRP标记山羊抗兔抗体(货号：S0001，Affinity公司)；ECL化学发光剂(货号：180-501，Tanon公司)

1.2 仪器Vevo 2100小动物超声检测仪(加拿大VisualSonics公司)；RM2245组织切片机(德国LeicaBiosystems公司)；BX43显微镜(日本Olympus公司)；Eppendorf 5417R离心机(德国Eppendorf公司)；Supply Mini-Protean3电泳仪、Mini Trans-Blot转移系统、ChemiDoc成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.3 实验动物分组、造模和给药60只♂ C57BL/6小鼠，于SPF级动物实验室适应性喂养1周，随机分为空白组(Control)、模型组(ISO)、ICA低剂量组(15 mg·kg-1，ICA-L)、ICA中剂量组(30 mg·kg-1，ICA-M)、ICA高剂量组(60 mg·kg-1，ICA-H)和氯沙坦组(9 mg·kg-1，LOS)，每组各10只。ISO组、ICA组和LOS组于颈背部皮下注射异丙肾上腺素(5 mg·kg-1)诱导心肌纤维化小鼠模型，Control组注射等体积生理盐水。ICA组按剂量灌胃ICA，LOS组灌胃氯沙坦，Control组和ISO组灌胃等体积双蒸水。造模和给药每日1次，持续14 d。

1.4 检测小鼠左心室功能造模及给药14 d后，禁食12 h，称小鼠体质量，常规性麻醉后剃除小鼠胸毛，将其固定在小动物超声检测台，在胸腔上涂抹适量超声耦合剂，将MS400探头置于小鼠左胸前，采用Vevo2100系统检测小鼠左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)。

1.5 计算小鼠心脏质量指数打开小鼠胸腔，取出心脏，用预冷的生理盐水洗净残留血液，滤纸吸干后称重，计算小鼠心脏质量指数(HMI)，HMI=心脏质量(mg)/体质量(g)。

1.6 观察小鼠左心室胶原纤维沉积情况分离小鼠左心室，取左心室组织，使用4%甲醛溶液固定24 h后脱水，石蜡包埋，组织切片机切片，进行Masson染色，用光学显微镜观察小鼠左心室胶原纤维沉积情况。每张切片随机选取5个视野，用ImageJ软件计算小鼠左心室心肌胶原容积分数(CVF)，取平均值。CVF/%=胶原面积/视野总面积×100%。

1.7 检测小鼠左心室α-SMA、MMP-2、MMP-9和TIMP-1的蛋白表达取小鼠左心室组织50 mg，剪碎，加500 μL RIPA裂解液和5 μL PMSF溶液，匀浆器冰上匀浆，静置30 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min，取上清液。BCA试剂盒测定上清液蛋白含量，配制8% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，半干转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，8%脱脂牛奶室温封闭2.5 h，TBST洗PVDF膜，4 ℃过夜孵育抗体：α-SMA(1 ∶2 000)、MMP-2(1 ∶1 000)、MMP-9(1 ∶1 000)、TIMP-1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)，TBST洗PVDF膜，室温孵育山羊抗兔抗体(1 ∶5 000)1 h，TBST洗PVDF膜，ECL发光剂显色，ChemiDoc成像系统获取图像。

2 结果

2.1 小鼠左心室功能变化与Control组相比，ISO组小鼠LVEF降低31.8%(P<0.05)，LVFS降低48.9%(P<0.05)；与ISO组相比，ICA-M、ICA-H及LOS组小鼠LVEF分别升高28.2%、38.5%、40.7%(P<0.05)，LVFS分别升高42.5%、54.7%、63.8%(P<0.05)，见Fig 1。

Fig 1 Effects of ICA on left ventricular function

2.2 小鼠心脏质量指数变化与Control组相比，ISO组小鼠HMI升高16.2%(P<0.05)；与ISO组相比，ICA-M、ICA-H及LOS组小鼠HMI分别降低7.2%、10.5%、11.8%(P<0.05)，见Fig 2。

Fig 2 Effects of ICA on HMI of

2.3 小鼠左心室胶原纤维沉积情况与Control组相比，ISO组小鼠左心室细胞间质胶原纤维沉积明显增加，CVF增大(P<0.05)；与ISO组相比，ICA-M、ICA-H及LOS组小鼠左心室细胞间质胶原纤维沉积明显减少，CVF减小(P<0.05)。其中，以ICA-H和LOS组最为明显，见Fig 3。

Fig 3 Effects of ICA on collagen deposition of left ventricle in

2.4 ICA对小鼠左心室α-SMA蛋白表达的影响与Control组相比，ISO组小鼠左心室α-SMA蛋白表达上调49.8%(P<0.05)；与ISO组相比，ICA-M、ICA-H及LOS组小鼠左心室α-SMA蛋白表达分别下调18.9%、22.6%、29.1%(P<0.05)，见Fig 4。

Fig 4 Effects of ICA on α-SMA protein expression in left ventricle of

2.5 ICA对小鼠左心室MMP-2蛋白表达的影响与Control组相比，ISO组小鼠左心室MMP-2蛋白表达下调45.8%(P<0.05)；与ISO组相比，ICA-M、ICA-H及LOS组小鼠左心室MMP-2蛋白表达分别上调52.3%、63.9%、86.5%(P<0.05)，见Fig 5。

Fig 5 Effects of ICA on MMP-2 protein expression in left ventricle of

2.6 ICA对小鼠左心室MMP-9蛋白表达的影响与Control组相比，ISO组小鼠左心室MMP-9蛋白表达上调66.8%(P<0.05)；与ISO组相比，ICA-M、ICA-H及LOS组小鼠左心室MMP-9蛋白表达分别下调26.6%、43.2%、59.7%(P<0.05)，见Fig 6。

Fig 6 Effects of ICA on MMP-9 protein expression in left ventricle of

2.7 ICA对小鼠左心室TIMP-1蛋白表达的影响与Control组相比，ISO组小鼠左心室TIMP-1蛋白表达下调61.9%(P<0.05)；与ISO组相比，ICA-M、ICA-H及LOS组小鼠左心室TIMP-1蛋白表达分别上调99.6%、137.4%、192.9%(P<0.05)，见Fig 7。

Fig 7 Effects of ICA on TIMP-1 protein expression in left ventricle of

3 讨论

心肌纤维化是导致心功能障碍、心源性猝死的潜在危险因素，是高血压心脏病、缺血性心肌病等的重要病理特征[1]。减轻心肌纤维化可以有效改善心脏功能障碍。研究表明，ISO以5 mg·kg-1每日颈背部皮下注射持续14 d，可以诱导小鼠心肌纤维化，导致心室收缩和舒张功能发生障碍[9]。氯沙坦是临床常用的AT1受体拮抗剂，具有减缓心肌纤维化的作用，在本研究中作为阳性对照药[10]。本研究中，ISO干预14 d后，小鼠的LVEF和LVFS明显降低，HMI明显升高，左心室细胞间质胶原纤维沉积明显增多，CVF增大，提示心肌纤维化模型构建成功；给予ICA(30、60 mg·kg-1)14 d后，小鼠LVEF和LVFS明显升高，HMI明显降低，小鼠左心室细胞间质胶原纤维沉积明显减少，CVF减小；与氯沙坦组相比较，ICA 60 mg·kg-1组对上述指标的影响差异无统计学意义。综上，提示ICA能够改善ISO诱导的小鼠心肌纤维化。

心肌ECM对心脏维持正常结构和功能至关重要，心肌纤维化的发展过程也是心肌ECM的病理性重构过程[11]。心肌受损后，心肌成纤维细胞在多种细胞因子的作用下转化为肌成纤维细胞[12]。与成纤维细胞相比，肌成纤维细胞分泌ECM的功能显著增强[13]。ECM过度沉积会导致心肌纤维化，使心脏功能减退。α-SMA是成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的重要标志物。本研究结果显示，ISO使小鼠左心室α-SMA蛋白表达上调；ICA(30、60 mg·kg-1)能抑制ISO所致的小鼠左心室α-SMA蛋白表达上调；与氯沙坦组相比较，ICA 60 mg·kg-1组对α-SMA蛋白表达的影响差异无统计学意义。结合ICA抑制ISO所致小鼠心肌纤维化的效应，提示ICA可能通过下调α-SMA的蛋白水平，抑制小鼠心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。

MMPs是一类需要依赖Zn2+、Ca2+等金属离子发挥催化活性的内源性肽链内切酶，能够通过调控ECM代谢，对损伤的心肌组织进行修复和重建[4]。MMPs包括胶原酶、明胶酶、间质溶解素、基质溶解素、膜型基质金属蛋白酶和其他酶类。明胶酶包括MMP-2和MMP-9。TIMPs可以通过抑制MMPs的活性，调控ECM的合成与降解[5]。正常情况下，心肌ECM的合成与降解处于平衡状态。当MMPs与TIMPs表达失衡会导致ECM合成与降解异常，引起心肌纤维化。值得注意的是：一方面MMPs促使ECM中的胶原蛋白降解，继而降解的胶原蛋白被缺乏连接结构的纤维性间质所取代，纤维胶原网络被破坏，导致心肌纤维化[14]；另一方面，当MMPs的表达过低，ECM的合成大于降解，继而导致ECM过量沉积，也促使心肌纤维化的发生[14]。

TIMP-1对MMP-9具有特殊的亲和力，能够抑制MMP-9的活性。Fu等[15]证实自发性高血压大鼠左心室组织的MMP-9表达上调、TIMP-1表达下调，导致心肌纤维化。Ma等[16]发现ISO通过下调MMP-2的表达促使小鼠心肌纤维化的发生。在本研究中，ICA(30、60 mg·kg-1)可以抑制小鼠ISO所诱导的左心室MMP-2蛋白表达的下调、MMP-9蛋白表达的上调及TIMP-1蛋白表达的下调；与氯沙坦组相比较，ICA 60 mg·kg-1组对以上蛋白表达的影响差异无统计学意义。结合以上资料，提示ICA一方面可能通过调节MMP-9和TIMP-1的表达失衡，抑制心肌纤维胶原网络被破坏，另一方面可能通过促进MMP-2的表达，抑制ECM过量沉积，改善ISO诱导的小鼠心肌纤维化。

综上所述，ICA能够改善ISO所诱导的小鼠心肌纤维化，其机制可能与调控α-SMA、MMPs/MMP-1的蛋白表达有关。

(致谢：本实验在遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室完成，在此对给予帮助的李意奇和皮婷婷表示感谢！)