LINC00705通过调控miR-143-3p影响口腔鳞癌细胞增殖及转移能力的探究

马稔秋 崔丽娟 杜炜

2018 年口腔癌新发病例约35.5 万，引起相关死亡约17.7万[1]，其中口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)占全部口腔癌的90%以上。手术联合化疗的治疗方案在临床收获了较好的疗效，但中晚期及复发OSCC的患者预后不佳，明确OSCC进展的机制对于相关诊断标志物及药物靶标的发现具有重要价值。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是表观遗传及转录调控的关键参与者，与肿瘤的发生发展密切相关，包括OSCC[2-3]，但以目前的发现仍不足以完全阐明影响OSCC进展的调控网络。本研究通过生物信息学检索发现与OSCC患者预后密切相关的LncRNA LINC00705，并通过分子生物技术明确了LINC00705的体外生物学效应及相关机制，揭示了该分子在OSCC诊断及治疗应用中的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及仪器

人胚肾细胞293T、人口腔上皮细胞系HOEC及人OSCC细胞系CAL-27、SCC-4、SCC-9、SCC-25及Tca8113(上海生命科学研究院)；DMEM、DMEM/F12培养基及胎牛血清(FBS)(Hyclone，美国)；RNAiso Plus(Trizol)、逆转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit、核酸荧光染料SYBR Green I(Takara，日本)；慢病毒包装载体、plvx-LINC00705及plvx-Vector载体、miR-143-3p mimic及NC mimic(上海汉恒生物)；转染脂质体Lipofectamine MessengerMAX(Thermo，美国)；CCK-8试剂(上海翊圣生物)；Tranwell小室及Matrigal基质胶(BD，美国)；Passive Lysis Buffer(PLB)裂解液、Luciferase Assay Reagent II及psiCHECK2载体(Promega，美国)。

1.2 临床样本资料

收集内蒙古赤峰学院附属医院口腔科2018 年09 月 01日～2019 年12 月20 日收治的46 例OSCC患者，所有患者均首次诊断为恶性肿瘤，术前未行任何形式的抗肿瘤治疗，所有提供肿瘤及癌旁组织的患者均对本研究知情同意，并签字。

1.3 细胞培养及处理

293T、CAL-27、SCC-4、SCC-9、SCC-25细胞采用DMEM+10%FBS培养，Tca8113细胞采用DMEM/F12+10%FBS培养，培养环境：37 ℃+5%CO2。利用慢病毒转染技术在Tca8113细胞中转染LINC00705过表达及相应的空白对照载体作为过表达组及空白组，在过表达组细胞中转染miR-143--3p mimic作为回复组；在SCC-9细胞中转染LINC00705敲降载体1#、2#及相应的干扰对照载体作为干扰1组、干扰2组及对照组。转染方法：在对数生长期的293T细胞中利用脂质体转染慢病毒包装载体+目的载体(1.5 μg)，收集病毒悬液与完全培养基1∶1混合培养Tca8113或SCC-9细胞3 d，1 μg/mL嘌呤霉素筛选细胞2 周以上。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

TRIzoL试剂提取临床组织样本或各组细胞的总RNA，逆转录试剂盒对1 μg总RNA进行逆转录，另取1 μg总RNA进行miR-143-3p特异性的逆转录，转录产物cDNA稀释至500 μL，将β-Actin、LINC00705及miR-143-3p引物与相应cDNA产物混合，在10 μL SYBR Green I体系中进行反应，反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min扩增循环30 次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。以β-Actin为内参基因，2-ΔΔCT公式计算LINC00705及miR-143-3p的相对表达水平。

1.5 CCK-8实验

以1 000 个/孔细胞密度接种各组细胞于96孔细胞培养板中，每组设置5 个重复孔，在细胞贴壁后的0、24、48、72 h及96 h于待测孔中加入10 μL CCK-8试剂，避光于37 ℃+5%CO2环境下培养3 h，检测450 nm处吸光度(A)值，以各时间点相比0 h A值增高的倍数衡量细胞相对增殖能力。

1.6 Transwell侵袭及迁移实验

无血清培养基稀释10×Matrigel基质胶，滴加至Transwell小室上室面中央，风干6 h后无血清培养基水化10 min备用。各组细胞消化重悬后进行细胞计数，调整细胞浓度至5×105个/mL并以含培养基+1%FBS重悬，200 μL细胞悬液接种至Transwell小室，下室面加入600 μL培养基+10%FBS，以含Matrigel基质胶的Transwell小室为侵袭模型，未含Matrigel基质胶的Transwell小室作为迁移模型，37 ℃+5%CO2环境下培养48 h，无水乙醇固定细胞10 min，0.1%结晶紫染色20 min，40×显微镜下拍照，采用ImageJ软件进行细胞计数。

1.7 荧光素酶报告基因实验

构建LINC00705全长序列+psiCHECK2载体(psiCHECK2-705)，接种293T细胞于6孔细胞培养板中，分为NC组及miR组，NC组通过脂质体转染psiCHECK2-705载体及NC mimic，miR组转染psiCHECK2-705载体及miR-143-3p mimic，转染后48 h，200 μL PLB裂解液处理细胞30 min，取10 μL加入避光的96孔板中，100 μL预混Luciferase Assay Reagent II检测荧光强度为RLU1，加入100 μL预混Stop&Glo Reagent检测荧光强度为RLU2，以RLU1/RLU2作为各组相对荧光强度。

1.8 统计学方法

使用SPSS 23.0软件进行统计学分析，单因素方差分析比较计量资料多组间差异，两两比较采用SNK-q法，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 生物信息技术分析LINC00705在 OSCC组织中的临床表达特征

根据GEPIA平台(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)中提供的数据显示，头颈鳞癌(head and neck squamous carcinoma，HNSC)组织中LINC00705表达显著高于正常癌旁组织(P<0.01，图 1A)，且高表达LINC00705的HNSC患者无病生存时间显著低于低表达患者(P<0.01，图 1B)。

图 1 LINC00705在 OSCC组织中的表达特征

2.2 病理组织中LINC00705和miR-143-3p的表达

RT-qPCR结果显示，相比正常癌旁组织，OSCC组织中LINC00705表达显著增高(P<0.01，图 2A)，miR-143-3p表达显著降低(P<0.01，图 2B)，两者在OSCC组织中表达显著负相关(R=-0.484，P<0.01，图 2C)，图 2D为口腔鳞癌组织HE染色。

图 2 OSCC中LINC00705及miR-143-3p的表达及其相关性

2.3 各组细胞LINC00705及miR-143-3p的表达比较

RT-qPCR结果显示，相比空白组，过表达组Tca8113细胞中LINC00705表达显著增高，miR-143-3p表达显著降低(P<0.01)，相比过表达组，回复组LINC00705表达无显著变化(P>0.05)，miR-143-3p表达显著增高(P<0.01，图 3A)；相比对照组，干扰1组及干扰2组SCC-9细胞中LINC00705表达显著降低(P<0.01)，miR-143-3p表达显著增高(P<0.01，图 3B)，图 3C为细胞转染后荧光表达情况。

图 3 各组细胞中LINC00705及miR-143-3p表达的比较

2.4 各组细胞增殖能力的比较

CCK-8结果显示，相比空白组，过表达组48 h及以后增殖能力显著增高(P<0.05)，相比过表达组，回复组48 h及以后增殖能力显著降低(P<0.01，图 4A)；相比对照组，干扰1组及干扰2组48 h及以后增殖能力显著降低(P<0.01，图 4B)。

图 4 各组细胞相对增殖能力的比较

2.5 各组细胞侵袭及转移能力的比较

Transwell侵袭及迁移结果显示，相比空白组，过表达组侵袭及迁移细胞数显著增多(P<0.01)，相比过表达组，回复组侵袭及迁移细胞数显著降低(P<0.01，图 5)；相比对照组，干扰1组及干扰2组侵袭及迁移细胞数显著降低(P<0.01，图 5)。

图 5 各组细胞的相对增殖能力

2.6 miR-143-3p对LINC00705荧光素酶表达的影响

LncBase Predicted v2平台(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web)分析结果显示，LINC00705与miR-143-3p存在碱基互补配对序列(图 6)。荧光素酶报告基因结果显示，相比共转染NC mimic载体(NC mimic相对荧光表达量：1.000±0.126)，转染miR-143-3p mimic可显著降低LINC00705荧光素酶的表达(miR-143-3p mimic相对荧光表达量：0.319±0.045，P<0.01)。

图 6 LINC00705与miR-143-3p预测结合区域

3 讨 论

LncRNA在恶性肿瘤中重要的生物学价值已被广泛的研究证实[4]，其可与蛋白直接结合，直接影响靶蛋白的结构及功能[5]，但更多是作为内源竞争RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)影响靶微小RNA(microRNA，miRNA)的生物学效应，进而间接调控miRNA的靶蛋白[6-7]。本研究通过生物信息技术发现LINC00705在OSCC组织中高表达，并与患者预后不良密切相关，提示LINC00705在OSCC中可能具有重要研究价值。而Liu等[8]研究发现LINC00705在乳腺癌复发患者的肿瘤组织中表达显著上调，暗示了LINC00705可作为乳腺癌预测复发的潜在标志物，因此，对LINC00705的靶miRNA进行分析，结果显示miR-143-3p与LINC00705转录本229-253序列存在互补序列，且连续互补片段为9-mer，提示结合可能性较强。而miR-143-3p被多项研究证实在不同来源的恶性肿瘤中发挥抑癌作用：He等[9]发现miR-143-3p在食管鳞癌组织中表达显著降低，且其低表达与患者预后不良密切相关，体内外研究显示RNA结合蛋白QKI-5是miR-143-3p的直接靶蛋白，miR-143-3p可通过抑制QKI-5 mRNA的表达，介导细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及细胞增殖转移能力的抑制；Chen等[10]发现miR-143-3p在乳腺癌组织中低表达，且受到MYB原癌基因样蛋白2(MYBL2)的负向调控，miR-143-3p的过表达可抑制乳腺癌细胞体内外的恶性表型；同时，miR-143-3p也参与调控OSCC的恶性表型，其被发现在OSCC组织中表达显著降低，且作为lncRNA UCA1及MALAT1的靶基因，显著抑制OSCC细胞的恶性行为[11-12]。另外miR-143-3p在结直肠癌、胰腺导管腺癌及宫颈癌中发挥抑癌作用[13-15]。

上述研究表明miR-143-3p作为抑癌因子在不同来源的恶性肿瘤中发挥生物学作用，而考虑到LINC00705在OSCC中有待阐明的生物学意义及其与miR-143-3p潜在的相互作用，本研究在OSCC临床组织样本中进行了LINC00705与miR-143-3p表达相关性的分析，结果显示两者表达显著负相关，提示了两者在OSCC中存在潜在的调控作用，体外研究显示，过表达LINC00705可促进OSCC细胞的恶性表型，而干扰LINC00705则抑制细胞的增殖转移能力。在回复miR-143-3p表达后，LINC00705的促癌作用被完全拮抗，同时，miR-143-3p对LINC00705荧光素酶的抑制作用提示两者存在相互结合作用。综上，本研究表明LINC00705可下调OSCC细胞中miR-143-3p的表达，促进细胞增殖及转移能力。在接下来的研究中将以balb/c裸鼠为体内模型探究LINC00705的体内生物学效应，并通过扩大临床样本及长期随访，明确LINC00705的临床意义，以期为相关药物靶标及诊断试剂盒的研发提供关键依据。