RNF181与Hippo/YAP对脑胶质瘤SHG44细胞恶性程度的影响及其可能机制

裴美娟，孙中磊，黄生炫，刘英富，李学文

脑胶质瘤是一种高侵袭性的中枢神经系统恶性肿瘤，与其他神经系统肿瘤相比，脑胶质瘤有更高的转移趋势，整体预后较差及生存率较低[1,2]。目前，脑胶质瘤缺乏合适的治疗靶点，因此，临床迫切需要发现脑胶质瘤的致癌机制和新型靶向疗法。近年来，越来越多的证据表明，Hippo/YAP信号通路在中枢神经系统发育和脑肿瘤中有重要作用[3]，耗竭YAP或药物抑制YAP可能导致细胞死亡和细胞生长抑制[4]。有研究表明，RNF181可以稳定YAP蛋白并抑制K48连接的多聚泛素化，从而导致乳腺癌的进展[5]。RNF181作为E3泛素连接酶可以抑制抗原受体信号转导到CARD11下游NF-κB信号通路负调控淋巴瘤细胞生存[6]，但关于RNF181在脑胶质瘤中的功能报道较少。本研究通过探究RNF181与Hippo/YAP对胶质瘤细胞恶性度的影响及其可能机制，旨在为临床诊治提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料 人胶质瘤细胞系SHG-44(上海中科院细胞库)，DMEM培养液、胎牛血清、胰酶(美国Gibco公司)，过表达RNF181mRNA腺病毒表达载体AAVrh.10 RNF181与无表达基因腺病毒衣壳AAVrh.10 Negative(济南思科生物科技有限公司)，RNF181、YAP(美国abcam公司)，MTT、Trizol及去RNA酶试剂(美国Cayman Chemical公司)，RT-PCR引物(赛默飞世尔科技中国有限公司)。Tranwell小室、细胞培养板及计数板(美国康宁公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞与分组 SHG-44细胞在DMEM培养液常规培养，分为3组：对照组(Control组)、阴性对照组(Negative组)和RNF181过表达组(RNF181组)。Negative组和RNF181组SHG-44细胞分别加入等滴度纯化的腺病毒表达载体AAVrh.10 Negative、AAVrh.10 RNF181，Control组加入等体积PBS，共培养12 h。根据细胞的密度进行换液或者传代。每次传代时，加入2.5 μg/ml嘌呤霉素继续筛选稳定的细胞株，每隔1 d于荧光显微镜观察细胞GFP荧光强度，直至荧光强度无明显变化，无死亡漂浮的细胞。将一部分细胞用于后续实验，其余冷冻保存。

1.2.2 RT-qPCR实验 使用Trizol试剂盒提取细胞内总RNA，利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA链，利用Real-timePCR试剂盒检测细胞内各蛋白mNRA的表达，GAPDH作为内参。引物序列如表1。

表1 各蛋白基因引物序列

1.2.3 MTT试验 取细胞悬液100 μl在有完全培养液的96孔板中培养至 2×105/孔(37 ℃、5%CO2)。用20 μl的MTT处理后，相同条件下继续培养4 h，加150 μl DMSO终止反应，用酶标仪测定各孔在490 nm 处的吸光值。

1.2.4 Transwell实验 利用无血清DMEM培养液重悬各组细胞至1×104/ml，取200 μl加入Transwell小室中，并将盛有细胞悬液的Transwell小室置于含有培养液的实验孔中培养24 h；取出后，PBS清洗，用棉签擦去小室结晶紫染色薄膜下层细胞后，置于显微镜下计数拍照。

1.2.5 Western blot检测 转染72 h后，取各组细胞破碎提取蛋白质。常规电泳分离蛋白后转膜。10%脱脂奶粉4 ℃封闭1 h，然后在含一抗的10%脱脂奶粉的TBST缓冲液过夜： RNF181(1∶1000)、Hippo(1∶1000)、YAP(1∶1000)和GAPDH(1∶1000)。二抗孵育后ECL plus检测信号，Image J软件定量分析。

1.2.6 免疫荧光检测 将细胞接种到培养玻片上，用4%多聚甲醛固定，并用0.1%Triton X-100透化。封闭后按照常规方法进行染色，将细胞与一抗GFAP(1∶2000)、RNF181(1∶2000)和抗YAP(1∶2000)抗体孵育，其中荧光共定位检测RNF181与YAP抗体同时加入样本，然后与二抗孵育，通过用DAPI染色细胞核。荧光显微镜扫描后Image J软件用于定量分析。

2 结 果

2.1 RT-qPCR实验结果 (1)转染后SHG-44胶质瘤细胞过表达RNF181：与对照组和Negative组相比，胶质瘤细胞系SHG-44中RNF181 mRNA及蛋白表达量均明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05，表2)。(2)RNF181过表达促进Hippo/YAP表达：与对照组和Negative组相比，RNF181过表达组YAP mRNA及蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 SHG44细胞3组实验结果比较

2.2 RNF181过表达促进SHG-44细胞增殖、迁移和侵袭 实验72 h MTT实验结果显示， 与对照组和Negative组细胞增殖率相比，RNF181过表达组细胞增殖率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光结果显示，与对照组和Negative组细胞数相比，RNF181过表达组细胞数明显增多，差异有统计学意义(P<0.05，图1，表3)。Transwell实验结果显示，与对照组和Negative组穿膜细胞数相比，RNF181过表达组的SHG-44穿膜细胞数明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，图2，表3)。

表3 3组RNF181过表达促进SHG-44细胞增殖、迁移和侵袭结果比较

图1 SHG-44细胞免疫荧光(×200)

图2 SHG-44细胞transwell(×200)

2.3 RNF181与YAP蛋白共表达 免疫荧光共定位染色显示，SHG-44细胞中YAP和RNF181共定位于细胞核内(图3)。

图3 RNF181与YAP蛋白共表达(×200)

3 讨 论

脑胶质瘤是最危及生命的原发性脑肿瘤之一，其发生、发展是一个涉及抑癌基因和致癌基因间平衡的多步骤过程，受到多基因的调控[7]。本实验研究发现，RNF181过表达能显著提高Hippo/YAP信号的表达，提高SHG-44的增殖能力与恶性度。与既往研究一致，YAP在人脑胶质瘤中表达上调，与患者预后恶化相关[8]。并且，通过免疫荧光共定位实验，本研究还发现RNF181与YAP共表达于细胞核中。因此，本研究推测RNF181过表达可能是脑胶质瘤Hippo/YAP信号激活的启动机制，RNF181可能作为脑胶质瘤治疗和诊断的新靶点。

Hippo信号通路从黑腹果蝇到哺乳动物高度保守，在器官大小控制、组织再生和肿瘤抑制等方面发挥重要作用，YAP是一种重要的转录共激活因子，受Hippo信号通路负调控[9]。Hippo信号通路也受到各种上游调控因子的调控，如细胞极性、黏附蛋白和其他信号通路(Wnt/β-catenin、Notch和MAPK通路)[8]。大量研究表明，Hippo/YAP信号对有些肿瘤有重要的致癌作用[10]。本研究发现，YAP表达提高后SHG-44的增殖和侵袭能力明显增强。还有研究发现，在小鼠模型中YAP被激活可能导致肝癌和肺癌[11]。此外，YAP被证明可介导几种与癌症相关的表型，包括迁移、侵袭、抗凋亡和上皮-间质转化(EMT)[12]。并且近年来，越来越多的证据表明，Hippo/YAP信号通路在中枢神经系统发育和脑肿瘤(包括胶质瘤)中发挥着重要作用[10]。因此，本研究结果提示YAP在胶质瘤细胞中至关重要，针对胶质瘤细胞的YAP靶点可能是一个很有前途的方向。

RNF181属于RING家族E3连接酶家族，而RING域负责E3连接功能，多种生理功能需要RNF181。 有研究发现，RNF181在几种人类恶性肿瘤中升高，RNF181可以与CARD11相互作用，并促进淋巴瘤细胞中的NF-κB信号传导[13]。此外，RNF181被证明可以促进结肠癌的生存能力和血管生成[14]。本研究证明了在胶质瘤细胞内过表达RNF181促进YAP蛋白表达，然而抑制RNF181 对YAP蛋白及胶质瘤细胞的作用仍不清楚，能否应用于脑胶质瘤临床治疗还有待研究。

综上所述，本研究结果表明，RNF181可以通过非蛋白水解的方式稳定YAP蛋白，促进Hippo/YAP信号传导，促进胶质瘤中的细胞增殖和迁移，这可能为泛素修饰在YAP蛋白和 Hippo信号传导中的作用提供新见解，为脑胶质瘤的临床治疗提供新的方向。