高压氧对糖尿病足创面组织中VEGF、EGF表达水平的影响

何明杰 甘忠贵 郑爱甜 黄 庆 吴标良

糖尿病足是糖尿病患者的重要并发症之一，也是糖尿病患者致残、致死的主要原因之一。研究数据显示，糖尿病患者在其一生中罹患糖尿病足的风险高达25%以上，罹患糖尿病足的患者年死亡率高达11%，而因糖尿病足截肢的患者死亡率高达22%［1］。糖尿病足患者因合并下肢血管或周围神经病变，局部组织营养状况及免疫力较差，易导致创面迁延不愈而发展为慢性溃疡。目前，临床主要采用局部清创、血管介入、负压封闭引流、高压氧等方法治疗糖尿病足，且近年来研究发现高压氧可通过改善局部动脉血流和组织供氧、减轻炎症反应、刺激生长因子释放等促进糖尿病足创面的愈合，在糖尿病足的治疗中取得了较好的临床疗效［2］。笔者鉴于血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）等细胞因子与创面的愈合密切相关［3］，于本研究中对比观察了高压氧对糖尿病足患者创面组织内VEGF、EGF表达水平的影响，以进一步指导高压氧在糖尿病足治疗中的应用，并为其提供理论支持。

1 临床资料

1.1 一般资料

选取2016年3月至2019年6月右江民族医学院附属医院收治的48例Wagner 1～2级糖尿病足患者作为研究对象，采用随机区组设计法将其随机分为研究组与对照组，每组24例。两组患者性别、年龄等一般资料对比，P均＞0.05，差异无统计学意义，具有可比性（表1）。本研究经右江民族医学院附属医院医学伦理委员会批准，且所有患者均签署了知情同意书。

表1 两组糖尿病足患者一般资料对比Table 1 Comparison of general data of patients with diabetic foot between the two groups

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：符合Wagner 1～2级糖尿病足的诊断标准［4］；对本研究知情同意。排除标准：入选前30 d内接受过生长因子或高压氧等治疗；合并创面严重感染或全身感染；合并有严重心、肝、肾等重要脏器功能障碍；合并有恶性肿瘤或其他免疫系统疾病；合并有沟通障碍性疾病或有精神病病史；长期使用糖皮质激素、免疫抑制剂、抗生素等药物。

2 方法

2.1 基础治疗

两组患者入院后均予以积极治疗基础疾病（空腹血糖控制在6～8 mmol／L，餐后2 h血糖控制在12 mmol／L以下，血压控制在130／80 mmHg左右）、改善微循环、根据创面分泌物病原学检查及药物敏感试验结果使用敏感抗生素抗感染、营养支持等对症支持治疗。

2.2 局部治疗

对照组：局部创面于生理盐水冲洗、坏死组织清除后，采用碘伏常规消毒创面及创周皮肤，并覆盖无菌敷料包扎，根据创面渗出情况每天换药1～2次。

研究组：在对照组常规清创换药治疗的基础上联合应用高压氧治疗，患者进入高压氧舱后，匀速加压20 min，使压力达到并维持在0.2 MPa；压力稳定后，患者戴面罩吸氧20 min，间隔5 min，重复循环吸氧3次；继而，匀速减压20 min至常压状态，结束治疗，每天1次，每周连续治疗5 d，共治疗2周。

2.3 观察指标及评价标准

对比观察两组患者创面组织形态学及VEGF、EGF表达水平变化情况。治疗第3、7、12天，随机取足部创面组织2份，1份采用福尔马林固定后石蜡包埋、切片、HE染色，显微镜下观察组织形态学变化；1份常规石蜡包埋、切片后，采用免疫组化SABC法检测VEGF、EGF表达水平。免疫组化SABC法：将切片置于温箱内孵育30 min后，二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化，继而置于高压蒸汽中加热行抗原修复，并对内源性过氧化物酶进行封闭；加入羊血清常温孵育1 h后，分别加入兔抗人VEGF、EGF多克隆抗体（1∶200），4℃冰箱内过夜；经辣根过氧化物酶标记的广谱二抗孵育1 h后，置于4℃冰箱内保存30 min；二氨基联苯胺溶液显色后，脱水、透明、封片。每例标本随机选取5个高倍视野（×400）进行观察，采用免疫反应积分法（immunoreactive score，IRS）［5］统计VEGF、EGF表达情况：胞浆或胞核内颗粒呈棕褐色为强阳性3分，棕黄色为阳性2分，淡黄色为弱阳性1分，未着色为阴性0分；阳性细胞百分比＞75%为4分，51%～75%为3分，26%～50%为2分，≤25%为1分；IRS积分＝染色强度积分×阳性细胞百分比积分，两次IRS积分均值作为最终结果。

2.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件对所得数据进行统计学分析，计数资料以频数或百分比表示，采用卡方检验；符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 两组患者创面组织形态学变化情况

治疗第3天，对照组患者创面组织可见明显水肿；研究组患者创面组织可见大量炎症细胞浸润与少量成纤维细胞分布。治疗第7天，对照组患者创面组织仍有水肿，可见炎症细胞和少量成纤维细胞；研究组患者创面组织内可见新生血管明显增多且排列整齐。治疗第12天，对照组患者创面组织内可见较多成纤维细胞，新生血管增多但排列仍较紊乱；研究组患者创面组织内可见大量成纤维细胞和排列整齐的新生血管。创面组织形态学典型图片见图1－6。

3.2 两组患者创面组织内VEGF、EGF表达情况

免疫组化检测结果显示，VEGF表达于血管内皮细胞及成纤维细胞胞浆内（图7－12），EGF表达于血管内皮细胞、成纤维细胞及炎症细胞胞浆内（图13－18）。

图1 －3 对照组患者治疗第3、7、12天创面组织HE染色典型图（×200）；图4－6 研究组患者治疗第3、7、12天创面组织HE染色典型图（×200）Fig.1－3 Typical graphs of HE staining of wound tissues of patients in the control group on day 3，7 and 12 of treatment（×200）； Fig.4－6 Typical graphs of HE staining of wound tissues of patients in the study group on day 3，7 and 12 of treatment（×200）

图7 －9 对照组患者治疗第3、7、12天创面组织VEGF免疫组化典型图（×400）；图10－12 研究组患者治疗第3、7、12天创面组织VEGF免疫组化典型图（×400）；图13－15 对照组患者治疗第3、7、12天创面组织EGF免疫组化典型图（×400）；图16－18 研究组患者治疗第3、7、12天创面组织EGF免疫组化典型图（×400）Fig.7－9 Typical immunohistological graphs of VEGF in the wound tissues of patients in the control group on day 3，7 and 12 of treatment（×400）； Fig.10－12 Typical immunohistological graphs of VEGF in the wound tissues of patients in the study group on day 3，7 and 12 of treatment（×400）； Fig.13－15 Typical immunohistological graphs of EGF in the wound tissues of patients in the control group on day 3，7 and 12 of treatment（×400）； Fig.16－18 Typical immunohistological graphs of EGF in the wound tissues of patients in the study group on day 3，7 and 12 of treatment（×400）

治疗第3、7、12天，两组患者创面组织内VEGF、EGF表达水平均逐渐升高，除治疗第3天两组患者创面组织内VEGF表达水平无显著差异外，治疗第7、12天研究组患者创面组织内VEGF表达水平及各时间点EGF表达水平均明显高于对照组（P均＜0.05），详见表2。

表2 两组糖尿病足患者创面组织内VEGF、EGF表达水平对比（±s）Table 2 Comparison of expression levels of VEGF and EGF in the wound tissue of patients with diabetic foot between the two groups（±s）

表2 两组糖尿病足患者创面组织内VEGF、EGF表达水平对比（±s）Table 2 Comparison of expression levels of VEGF and EGF in the wound tissue of patients with diabetic foot between the two groups（±s）

注：VEGF为血管内皮生长因子、EGF为表皮生长因子；研究组患者采用常规清创换药联合高压氧治疗，对照组患者采用常规清创换药治疗Note：VEGF－vascular endothelial growth factor，EGF－epidermal growth factor.Patients in the study group were treated with the conventional debridement and dressing change combined with hyperbaric oxygen therapy，whereas patients in the control group were treated only with the conventional debridement and dressing change

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4 讨论

创面愈合包括炎症反应期、肉芽组织增生期、瘢痕形成期3个阶段，由多种细胞因子、炎症因子共同参与［6］。相关研究显示，糖尿病足创面迁延不愈与创面组织细胞内生长因子及其受体相对或绝对缺乏密切相关［7］。VEGF作为唯一作用于血管内皮细胞的特异性促血管生成因子，能够通过促进血管内皮细胞的增殖、迁移参与新生血管的形成；EGF可通过促进内皮细胞和成纤维细胞的新生、增殖而加快创面的再生修复。因此，有效提高糖尿病足患者创面组织内VEGF、EGF的表达水平对促进创面愈合具有重要意义。

相关研究显示，高压氧可通过提高血液含氧量而促进糖尿病足创面的愈合，还可通过提高内皮细胞一氧化氮合酶的活性，增加一氧化氮的合成及分泌，促进新生血管的生成而加速创面愈合。本研究结果显示，高压氧治疗的研究组患者在治疗第7、12天时创面组织内VEGF表达水平及治疗第3、7、12天时EGF表达水平均明显高于常规清创换药治疗的对照组，肉芽组织及新生血管形成明显早于对照组，与刘艳萍等［8－10］的研究结果基本一致。目前，有研究学者认为巨噬细胞M1亚型产生的高水平氧化代谢产物和肿瘤坏死因子⁃α、白细胞介素⁃6等促炎细胞因子可损伤健康组织细胞，而巨噬细胞M2亚型可通过上调内皮细胞分泌VEGF及抑炎因子白细胞介素⁃8的水平加快血管的再生和基质的重塑，而高压氧可促使M1型巨噬细胞向M2型转化，减轻创面炎症反应，提高VEGF的表达水平，加快创面组织的再生修复［11－12］。且有研究显示，高压氧还可在抑制氧自由基生成的同时，提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等的活性，加快氧自由基的清除，减轻创面炎症反应程度，且此过程中活性氧的大量生成还可上调EGF等生长因子的表达水平，促进血管内皮细胞、成纤维细胞的新生，加快创面组织的修复［13－15］。

综上所述，高压氧可通过上调创面组织内VEGF、EGF的表达水平，促进新生血管的生成，加快肉芽组织的生长，进而提高糖尿病足创面的愈合速度，值得临床推广应用。